药物诱导后胚胎胰腺干细胞胰岛素分泌研究

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(1 青岛大学医学院血液学检验教研室，山东 青岛 266071； 2 青岛市市立医院肝胆外科; 3 青岛大学医学院附属医院神经外科)

糖尿病特别是Ⅰ型糖尿病严重威胁人类的健康，传统的药物治疗方法只能暂时控制病情，并不能达到完全治愈的目的。目前胰岛移植被认为是可以完全治愈糖尿病的一种方法[1]，但是其应用受到供体不足的制约。近年来大量研究显示，可以利用药物体外诱导胚胎胰腺干细胞向胰岛素分泌细胞分化。本实验应用药物诱导人胚胎胰腺干细胞，测定诱导后的胰岛素分泌细胞(IPCs)的胰岛素分泌情况，旨在为临床移植提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及其来源

引产的人胚胎(胎龄约20周)，由青岛市市立医院产科提供，孕妇自愿终止妊娠，胚胎的使用得到孕妇本人同意。D-Hank液、V型胶原酶、表皮生长因子(EGF)、Betacellulin、烟酰胺、双硫腙(DTZ)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，胎牛血清、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、RPMI 1640培养基、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(美国Invitrogen公司)，肝细胞生长因子(HGF)、激活素A(美国R&D systems)，胰升糖素样多肽-1(GLP-1)(美国ProSpec)，小鼠抗人巢蛋白单抗(北京中杉金桥有限公司)，人胰岛素ELISA试剂盒(上海蓝基生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1人胚胎胰腺胰岛样细胞簇的分离培养及诱导分化 参考文献[2-3]的方法，无菌条件下取出胚胎胰腺，分离培养若干天后，吸出悬浮的胰岛样细胞簇(ICCs)[2]，接种到新的细胞培养瓶中，诱导分化培养基中继续诱导6 d[3]。

1.2.2胚胎胰腺干细胞的鉴定 取分离出的ICCs，制备细胞爬片，使用丙酮甲醇溶液固定，室温下放置15 min，0.1 mol/L PBS洗3 min，共3次，以体积分数0.03的双氧水孵育30 min。正常山羊血清封闭，37 ℃孵育30 min，加1∶100稀释小鼠抗人巢蛋白单抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗3 min，共3次，滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育15 min，PBS洗3 min，共3次；DAB溶液染色，苏木精复染，甘油封片，显微镜下观察。

1.2.3IPCs的鉴定 取DTZ 10 mg溶于10 mL的DMSO，以0.22 μm孔径的滤膜过滤除菌待用。对诱导6 d后的细胞进行DTZ常规染色，每1 mL胰岛制备物与10 μL的储存液混合，37 ℃孵育10～20 min后镜检。

1.2.4细胞培养液中胰岛素含量的测定 将诱导后DTZ染色阳性的细胞铺于24孔板，计数板计数培养液中细胞密度，保证每孔的细胞密度为1×109/L左右，每隔24 h加入高浓度(25.0 mmol/L)或低浓度(5.5 mmol/L)葡萄糖溶液刺激后，吸取培养液上清液于EP管中，-20 ℃保存待测。连续刺激2周，测定上清液中胰岛素的含量。测定方法按照人胰岛素ELISA试剂盒说明书进行，酶标仪读板，根据标准品浓度和吸光度(A)值绘制标准曲线，依次读出样本的胰岛素浓度，计算出平均值。

1.2.5统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行处理。所有计量资料均进行正态检验和方差齐性检验。两组定量资料比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 免疫组化法鉴定胚胎胰腺中胰岛样细胞簇

胚胎胰腺干细胞的细胞核和胞浆着色呈棕黄色(图1)，为巢蛋白阳性细胞。

2.2 DTZ染色

对诱导6 d后的细胞与未经诱导的细胞分别进行DTZ染色，诱导后细胞染色呈猩红色(图2a)，而未诱导细胞仍呈棕黄色(图2b)。

2.3 ELISA法测定IPCs在葡萄糖刺激下胰岛素分泌情况

诱导后细胞在高浓度葡萄糖(25.0 mmol/L)或低浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)溶液刺激下胰岛素分泌量分别为(137.41±6.02)和(106.40±8.61)U/L，两者比较差异有显著性(t=7.228,P<0.01)。

2.4 诱导后的IPCs 2周内胰岛素分泌情况

诱导后的IPCs在糖溶液刺激后，第1、3、5、7、9、11、13天的胰岛素分泌量分别为(130.21±1.39)、(135.22±1.24)、(137.99±1.59)、(143.67±2.40)、(143.78±2.27)、(134.47±1.39)、(126.81±1.89)U/L。第7～9天胰岛素分泌量与其他各天比较，差异有显著意义(F=38.373,q=3.033～6.085,P<0.05)；第7天与第9天比较差异无显著意义(P>0.05)。

3 讨 论

糖尿病特别是Ⅰ型糖尿病一直是威胁人类健康的一大常见疾病，迄今尚未找到治愈的方法，严重影响病人的生活质量，已成为内分泌系统疾病一大顽疾[4]。近年研究表明，胰岛移植有望彻底治愈Ⅰ型糖尿病，然而由于供体胰腺缺乏，一直未能很好地开展该项工作。近年来研究显示，IPCs的分化有望解决供体不足的问题。随着干细胞生物学的发展，运用干细胞产生能分泌胰岛素的细胞或组织的研究受到关注。大量研究已证实，应用特定的诱导因子可诱导干细胞向所需要的细胞分化，因此胚胎胰腺干细胞也可在特定因子的诱导下向IPCs分化[5]。巢蛋白是细胞内一种中间丝蛋白，最初发现在神经干细胞中特异性表达[6]；后来研究显示，从人和大鼠的胰岛中分离得到的巢蛋白阳性细胞体外培养也有很强的增殖能力，并有多向分化潜能，因此胰腺中巢蛋白阳性细胞可作为胰腺干细胞的标志，可在体外经诱导分化为IPCs[3]。正常的胰岛β细胞中含有大量的锌，而DTZ是一种锌螯合剂[7]，能将胰岛细胞染成猩红色或棕红色，因此，DTZ染色是鉴定胰岛细胞的特异染色方法。

本研究结果显示，高浓度葡萄糖刺激下IPCs胰岛素分泌量明显高于低浓度葡萄糖刺激，这说明诱导后的细胞具有胰岛细胞的基本特征[8]，类似体内胰岛。虽然大量研究证明了诱导后细胞具有内分泌能力，但这种能力能维持多久，每天的分泌量如何变化还未有太多报道。本实验在胚胎胰腺干细胞诱导成功的基础上，检测葡萄糖溶液刺激下IPCs每天的胰岛素分泌情况，观察短期内胰岛素分泌量的变化。研究显示，离体条件下，胚胎胰腺干细胞经药物诱导后具有胰岛分泌能力，诱导后细胞2周内可持续分泌胰岛素，其胰岛素分泌量在诱导后1周左右达到最大值，随后分泌量有所降低，这一结果与利用胎儿骨髓间充质干细胞体外诱导分化为IPCs的胰岛素分泌情况相似[9]。具体原因尚不清楚，可能与培养过程中培养液成分和酸碱度的改变，以及细胞凋亡等情况有关。因此，诱导后第7～9天可作为选择移植的最佳时期。但单纯药物诱导，IPCs的胰岛素释放量较正常的胰岛细胞仍有很大的差异，仅为正常β细胞的1/50[10]，移植到动物或人体后这类细胞能发挥怎样的作用，还有待于进一步研究。

图1 巢蛋白免疫组化染色(100倍)

a：诱导后细胞DTZ染色呈猩红色；b：未诱导细胞DTZ染色不着色。

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