超声波辅助抽提法在孔雀石绿分子印迹固相萃取中的应用

吕翠翠，袁 敏，石服鑫，曹 慧，徐 斐，于劲松

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

超声波辅助抽提法在孔雀石绿分子印迹固相萃取中的应用

吕翠翠，袁 敏，石服鑫，曹 慧，徐 斐，于劲松

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

采用沉淀聚合法制备孔雀石绿分子印迹聚合物(MG-MIPs)，以洗脱效率及吸附量为指标，考察超声波辅助抽提法对MIPs中MG洗脱效果及吸附性能的影响，通过扫描电镜观察MIPs的表面形态，并对其吸附性能进行研究。结果表明：模板分子MG在超声30 min、超声10次、料液比m(MG-MIPs)∶V(甲醇-乙酸溶液)为1∶ 10(g/mL)、温度为25 ℃、超声功率为270 W的条件下，洗脱效果最好，MIPs在固相萃取柱中的吸附效率较高，达到198 μg/g。

分子印迹；固相萃取；模板洗脱；超声波辅助抽提；孔雀石绿

固相萃取是近年来发展起来的一种样品预处理技术，主要用于样品的分离和浓缩，然而传统的固相萃取技术存在选择性差的不足[1-2]。分子印迹聚合物 (molecularly imprinted polymers,MIPs) 是一种对特定分子具有专一识别性能的高分子材料，其特异性和亲和性为食品安全检测中痕量物质的富集与分析提供了便利[3]。将MIPs作为固相萃取填料，有助于增强萃取的选择性和吸附容量，但MIPs中模板分子的洗脱限制了其在固相萃取中的应用。目前，常用的模板分子洗脱方法为索氏抽提法，该法耗时、耗溶剂且洗脱效果欠佳[4]，因而迫切需要寻找一种快捷高效的洗脱方法。超声波辅助抽提法因其具有高效、操作简便等优点在分子印迹固相萃取中得到广泛应用[5]。

孔雀石绿(malachite green，MG) 主要用于治疗各类水产动物的水霉病[6],由于其易在生物体内和环境中长期残留，且对人体具有致癌、致畸、致突变等毒害作用[7-10]，因而已被许多国家列为水产养殖禁用药物[11]。我国于2002年5月出台的国标(GB/T 19857—2005)规定孔雀石绿在水产品中的检出率不得超过1 ng/g[12]。但由于孔雀石绿防治水霉病的效果显著且价格低廉，目前仍有部分不法分子违规使用[10]。

基于此，本试验采用沉淀聚合法制备孔雀石绿分子印迹聚合物，以洗脱效率及吸附量为指标，考察超声波辅助抽提法对MIPs中MG洗脱效果及吸附性能的影响，通过扫描电镜观察了MIPs的表面形态，并对其吸附性能进行研究。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

孔雀石绿标准品，Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸、甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

JY92-IIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新艺超声设备有限公司；UV-6000型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；Breeze HPLC高效液相色谱仪，Waters公司；Quanta FEG FEI扫描电子显微镜(SEM)，FEI公司。

1.3 MG-MIPs的制备

取0.5 mmol MG于100 mL锥形瓶中，用40 mL乙腈超声溶解10 min，再加入4.0 mmol MAA，摇匀，避光静置30 min。向以上体系中加入20.0 mmol EGDMA和40 mg引发剂AIBN，超声10 min后充N210 min，密封并于60 ℃水浴聚合24 h。除不加模板分子，非印迹聚合物(NIPs)的制备过程同上。

1.4 超声波辅助抽提法对MG-MIPs模板分子的洗脱

采用超声波辅助抽提法对MG-MIPs的模板分子进行洗脱，以洗脱后MG的残留量和MG在MIPs固相萃取柱中的吸附量为指标，考察超声时间、洗脱次数、料液比、温度、超声波功率对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响。

1.4.1 高效液相色谱(HPLC)对模板分子的检测

采用HPLC检测洗脱液中模板分子MG的残留量，直至无模板分子析出。液相色谱条件为：C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相 0.05 mmol/LV(乙酸铵)∶V(乙腈)为2∶ 8，流速1 mL/min，柱温室温，进样量20 μL。

1.4.2 MIPs固相萃取柱对模板分子的吸附

将不同洗脱条件下获得的MG-MIPs于60 ℃真空干燥至恒质量，各取100 mg于6 mL空柱中干法装柱，所得固相萃取小柱(MIPSE)依次用5 mL甲醇、5 mL乙腈活化。取3 mL 3 μg/mL MG溶液以0.2 mL/min 的流速过MIPs柱，然后淋洗，用2 mL的V(甲醇)/V(乙酸)为9混合液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至干，用甲醇/乙酸定容至2 mL，经0.45 μm滤膜过滤后采用HPLC测定MG浓度。

1.5 平衡吸附实验

准确称取20 mg MIPs、NIPs于具塞试管中，分别加入3 mL不同浓度(0.5～20 μg/mL)的MG乙腈溶液，置于水浴振荡器中恒温振荡24 h后，移取适量上层清液，微滤。用乙腈将滤液稀释至合适的浓度，并于618 nm处测定平衡吸附液中MG的游离浓度。根据结合前后溶液中MG的浓度变化计算聚合物对MG的吸附量(Q)。根据Q值绘制MIPs的结合等温线图和Scatchard图，并评价MIPs的结合性质。

1.6 MIPs的SEM分析

将样品粘在托盘上的导电胶上，放进真空舱抽真空，喷金，结束后于扫描电子显微镜上观察MG-MIPs的形貌及粒径大小。

2 结果与讨论

2.1 超声时间对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响

超声时间对MIPs中模板分子的洗脱及吸附性能有一定的影响。超声时间过长，其超声能量可能会破坏MIPs的结构，从而降低MIPs在分子印迹固相萃取柱中对MG的吸附效率；超声时间过短，MIPs与模板分子之间的非共价键还没有完全断裂，模板分子溶出不充分，进而影响其在固相萃取中的应用。因而，考察超声时间对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响，结果如图1所示。其余超声条件为：超声10次，每次超声后换液，料液比1∶ 10 g/mL，温度25 ℃，超声功率270 W。

图1 超声时间对MIPs中模板分子洗脱效果 及吸附性能的影响Fig.1 Effects of extraction time on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由图1可见：超声30 min时，洗脱液中MG的残留量较低，为3.29 ng/mL，已达到高效液相色谱仪法的检测限，洗脱后MIPs在分子印迹固相萃取柱中对MG的吸附量达到198 μg/g。这可能是由于功能单体MAA的羧基与孔雀石绿的碱性氨基之间形成的氢键或离子键已断裂，MG溶出较为充分，同时，能量适中的超声波保持了MIPs结构的完整，使其在固相萃取柱中对MG具有较强的吸附能力。此外MIPs对MG的吸附量显著高于NIPs对MG的吸附量，表明在印迹聚合物中存在MG的特异结合位点。因此，选择30 min为最适超声时间。

2.2 洗脱次数对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响

超声次数是决定MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的重要因素之一，因而考察了洗脱次数对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响，结果如图2所示。其余超声条件为：每次超声30 min，料液比1∶ 10(g/mL)，温度25 ℃，超声功率270 W。

图2 洗脱次数对MIPs中模板分子洗脱效果 及吸附性能的影响Fig.2 Effects of extraction times on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由图2可见:随着超声次数的增加，MIPs中残留的模板分子浓度迅速降低，当超声次数达到10次以上，洗脱液中残留的模板分子低于3.50 ng/mL，且随着超声次数的进一步增加，不再发生显著变化。这可能是由于较少的超声次数使得洗脱液受到的负压力不足，空化作用弱，MG无法充分溶出，因而残留量较高，进而降低了固相印迹柱的萃取效率,故选定超声次数为10次为宜。

2.3 料液比对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响

考察料液比对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响，结果如图3所示。其余超声条件为：每次超声30 min，超声10次，温度25 ℃，超声功率270 W。

图3 料液比对MIPs中模板分子洗脱效果 及吸附性能的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratios on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由图3可见：当料液比小于1∶ 10(g/mL)时，MIPs中残余的模板分子浓度相对较高，这可能是由于料液比较低时，模板分子在洗脱液中的浓度迅速达到平衡，降低了洗脱效率，进而影响MIPs在固相萃取柱中对MG的吸附效果。当料液比小于1∶ 10(g/mL)时，MG残留量为2.62 ng/mL，MIPs在固相萃取柱中对MG的吸附量达到较高的水平，其值为205 μg/g，这与料液比为1∶ 10(g/mL)时MIPs对MG的吸附数值无显著差异,因此最适料液比为1∶ 10(g/mL)。

2.4 温度对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响

考察了温度对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响，结果如图4所示。其余超声条件为：每次超声30 min，超声10次，料液比1∶ 10(g/mL)，超声功率270 W。

图4 温度对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响Fig.4 Effects of temperature on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由图4可见:温度对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响并不显著。印迹聚合物中功能单体上的功能基与模板分子通过离子键或氢键结合，虽然温度可为价键的断裂提供一定的能量，但相对超声波本身的空化作用及能量而言，这种破坏作用较小，故温度对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响并不显著。为便于实验操作，选定25 ℃为洗脱温度。

2.5 超声波功率对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响

考察了超声波功率对MIPs中模板分子洗脱效果及吸附性能的影响，结果如图5所示。其余超声条件为：每次超声30 min，超声10次，料液比1∶ 10(g/mL)，温度25 ℃。

图5 超声波功率对模板分子洗脱效果及 MIPs吸附性能的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由图5可见:当功率过低时，超声波能量太弱，模板分子与MIPs之间的价键无法断裂，使得包埋于高度交联的网状分子印迹聚合物中的MG无法快速溶出，洗脱效率降低，进而影响固相萃取柱中MIPs对MG的吸附。而较高的超声波能量不仅使MG与MIPs之间的氢键、离子键断裂，更使形成印迹聚合物框架的价键断裂，导致整个MG-MIPs的结构坍塌，MIPs在固相萃取柱中对MG的吸附量大幅度降低。因此，选定超声波功率270 W为宜。

2.6 平衡吸附实验

采用平衡吸附实验考察印迹聚合物的结合特性。在孔雀石绿质量浓度为0.5～20 μg/mL范围内，测定聚合物对不同初始浓度孔雀石绿溶液的结合量，结果如图6所示。由图6可见：在研究的浓度范围内随着孔雀石绿浓度的增加，单位质量MIPs对模板孔雀石绿分子的吸附量也随之增加，可以明显地看出MIPs的吸附量大于NIPs的吸附量，表明在印迹聚合物微球中存在特异的结合位点。

图6 孔雀石绿印迹聚合物的结合等温线Fig.6 Binding isotherm of MG-MIPs

图7 MIPs的Scatchard曲线Fig.7 Scatchard curve of MIPs

根据吸附等温线数据，进行Scatchard分析，考察聚合物对孔雀石绿的结合情况。Scatchard方程为Q/ρ=(Qmax-Q)/Kd，式中ρ为溶液中孔雀石绿的平衡质量浓度(μg/mL)；Qmax为结合位点最大表观结合量；Kd为结合位点的平衡离解常数，Kd=-1/斜率。以Q/ρ对Q作图得图7。从图7可以看出，Q/ρ对Q呈非线性关系，说明聚合物中的结合位点是非均一性的。图中有2个部分呈线性关系，据此判断在测定的浓度范围内，MIPs对孔雀石绿分子存在两类不同的结合位点。由两端直线的斜率和截距可近似求得高亲和力结合位点的平衡离解常数Kd1=11.223 μg/mL，

最大表观结合量Qmax1=4.45×102μg/g；低亲和力结合位点的平衡离解常数Kd2=156.25 μg/mL，最大表观结合量Qmax2=5.033×103μg/g。

2.7 孔雀石绿分子印迹聚合物的SEM分析

图8为孔雀石绿分子印迹聚合物的SEM照片。由图8可见，在相同条件下制备的非印迹聚合物和印迹聚合物，形态为微球状，无明显差异，主要粒径为0.5～1.5 μm，粒子之间存在一定的黏连。沉淀聚合物微球是在大量反应介质中形成的，沉淀聚合发生于由均相的印迹分子、功能单体、交联剂以及引发剂组成的混合溶液中。引发剂引发聚合反应，生成可溶于连续相的线型和支链的低聚物；随着低聚物分子链增长，低聚物在连续相中的溶解度逐渐降低，最终从连续相中沉淀出来，形成聚合物核；聚合物核之间相互碰撞、聚集，并不断吸收单体、自由基以及低聚物逐渐长大，最终形成聚合物微球。

图8 分子印迹聚合物的扫描电镜照片Fig.8 SEM images of MG imprinted polymers

3 结 论

1)采用超声波辅助抽提法洗脱孔雀石绿分子印迹聚合物中的模板分子，最优洗脱条件为：超声时间30 min，超声10次，料液比1∶ 10(g/mL)，温度25 ℃，超声功率270 W。在此最佳洗脱条件下，印迹聚合物中MG的残留量低于3 ng/mL，已达到HPLC的检测限，洗脱后的MIPs在固相萃取柱中对MG的吸附量达到198 μg/g，表明制备的印迹聚合物可以用于食品中MG的富集与检测。

2)采用沉淀聚合法制备的分子印迹聚合物微球，粒径为0.5～1.5 μm，粒子之间存在一定的黏连。

3)平衡吸附实验表明在孔雀石绿质量浓度为0.5～20 μg/mL内，MIPs、NIPs的吸附量随着孔雀石绿浓度的增加而增大，MIPs的吸附量显著大于NIPs的吸附量。Scatchard分析表明MIPs对孔雀石绿分子存在两类不同的结合位点。

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(责任编辑 荀志金)

Application of the ultrasound-assisted extraction inmolecularly imprinted solid phase extraction of malachite green

LYU Cuicui,YUAN Min,SHI Fuxin,CAO Hui,XU Fei,YU Jinsong

(School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

Malachite green(MG)-molecularly imprinted polymers(MIPs) were prepared via precipitation polymerization.Using elution efficiency and adsorption of malachite green as indexes,we studied the effects of ultrasonic-assisted extraction on the elution of malachite green and adsorptive property of molecularly imprinted polymers were studied.Surface structure of molecularly imprinted polymers was observed by scanning electron microscope (SEM).Adsorption properties of molecularly imprinted polymers were studied.Results show that the optimum technical parameters for elution efficiency were 30 mins,10 times,the ratio of MG-MIPs to methanol-acetic acid solvent=1/10(g/mL),25 ℃ and 270 W.The adsorption properties of molecularly imprinted polymers in solid phase extraction column attained 198 μg/g.

molecular imprinting;solid phase extraction;template removal;ultrasound-assisted extraction;malachite green

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.014

2013-07-10

上海市自然科学基金(11ZR1424400)

吕翠翠(1988—)，女，山东德州人，硕士研究生，研究方向：食品安全快速检测；曹 慧(联系人)，副教授，E-mail：caohuian@126.com

TQ461

A

1672-3678(2014)06-0073-05