结肠癌HCT-116细胞增殖及细胞周期的影响

张 剑，吴 敏，张自森，王利娟，张红巧，师广勇，巴 楠，闫 琳，郑晓珂，邢 鑫

（郑州大学第五附属医院肿瘤科 450052）

结肠癌是常见的消化系恶性肿瘤，其在欧美国家发病率较高，在发展中国家发病率较低，但近年来，随着生活水平及饮食习惯的改变，我国结肠癌的发病率和病死率明显升高。SLP-2基因属于stomatin基因家族成员，是2001年新发现的一个基因［1］，近年来的研究显示，SLP-2 在多种恶性肿瘤中过表达，可能是一个新的肿瘤相关基因［2-6］。本研究采用免疫组织化学法检测SLP-2 在人结肠癌配对组织中的表达，并通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调结肠癌细胞HCT-116 中SLP-2 的表达，检测转染后HCT-116 细胞中SLP-2 的表达情况，并检测转染后HCT-116 细胞增殖及周期的变化，旨在探讨结肠癌中SLP-2 的表达特点及SLP-2 对结肠癌细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 结肠癌组织及距离癌组织边缘大于5 c m的癌旁正常结肠组织为郑州大学第五附属医院2010年1月至2011年1月手术切除结肠癌标本，共50例，其中男27例，女23例，年龄40～72 岁，中位年龄63 岁。所有标本均经病理学检查确诊为结肠癌，术前未接受过放、化疗。临床分期按TNM分期标准（AJCC）2010年第7 版，其中早期结肠癌（Ⅰ＋Ⅱ期）13例，晚期结肠癌（Ⅲ＋Ⅳ期）37例。

1.2 细胞培养 结肠癌细胞系HCT-116 购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。用含抗菌药物和10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液于37 ℃、5%CO2培养箱中，3～5 d传代1 次。

1.3 siRNA转染构建的SLP-2s i RNA序列正向引物：5′-UGC UGC CUG AUU UAU CUG UUC AGC C-3′，反向引物：5′-GGC UGA ACA GAU AAA UCA GGC AGC A-3′由上海吉玛公司设计合成。细胞按5 ×104／孔接种于24 孔板上，参考LipofectamineTM2000说明书，50μL的RPMI-1640 无 血 清 培养液中加入20 pmol SLP-2 siRNA混匀，Lipofectamin 试剂，用50μL 无血清的RPMI-1640 培养液稀释1μL Lipofectamin 试剂，混匀。将稀释好的SLP-2 siRNA和Lipofectamin试剂混合，轻柔混匀，室温放置20 min，以形成SLP-2 siRNA／Lipofectamin 复合物；将以上混合液加到含有细胞和培养基的培养板孔中，在5%CO2培养箱中37 ℃孵育24 h 后更换完全培养基继续培养，设为实验组。实验设阴性对照组（转染阴性对照siRNA）和空白对照组（不转染siRNA）。

1.4 RNAi 有效时间点的筛选 分别于转染后24、48 和72 h收集细胞，进行RT-PCR 及Wester blot 检测，比较上述3 个时间点的siRNA干扰效果的差异，从中找到最为有效的时间点。SLP-2 扩增片段长度：500 bp，上游引物5′-CTG GAG CCT GGT TTG AAC AT-3′；下游引物5′-AGG ATC TGG GCC TGT TTC TT-3′。内参β-actin 扩增片段长度242 bp，上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG ACC-3′；下游引物5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反应体系：2 ×Taq PCR Master Mix 12.5μL，SLP-2 及内参上、下游引物各1μL，cDNA 2μL，dd H2O补至25μL。PCR反应条件，预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，50 s，30 循环；延伸72 ℃，7 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条带图像凝胶成像仪扫描，以SLP-2 与β-actin 的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相对表达水平。SLP-2 单克隆抗体和抗β-actin 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司。提取HCT-116细胞总蛋白，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，稳流冰浴电转膜，分别与抗辣根过氧化物酶连接的二抗（美国Santa Cruz 公司）孵育，DAB 显色拍照。

1.2 免疫组织化学 鼠抗人SLP-2 单克隆抗体稀释度为1∶200，购自美国Proteintech 公司。免疫组织化学试剂盒购自迈新公司。用已知阳性片（子宫内膜癌切片，为公司提供）作阳性对照用PBS 代替一抗作阴性对照。操作步骤按试剂盒说明书进行。结果判定标准参照文献［7］，由两位高年资病理医师在双盲条件下进行评分，每张切片根据阳性细胞百分数及阳性细胞染色程度进行评分。细胞膜及细胞质染色程度评分由每张切片的大多数细胞染色情况决定，0 分：无着色，1分：浅黄色为，2 分：黄色，3 分：棕黄色。阳性细胞百分数评分，0 分：没有阳性细胞，1 分：1%～25%阳性，2 分：26%～50%阳性，3分：51%～75%阳性，4 分：＞75%阳性。二者分数相乘为总分，≥8 分为高表达，＜8 分为阴性或低表达。

1.5 噻唑蓝（MTT）试验 取转染后24、48、72、96 h 转染组、阴性对照组及空白对照组的HCT-116 细胞，每孔加入200μL 5 mg／mL MTT，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养4 h。弃MTT，每孔加入200μL 二甲基亚砜（DMSO），酶标仪测定490 nm处的吸光度（OD）值。

1.6 流式细胞术检测细胞周期 收集转染SLP-2 siRNA 48 h 后转染组、阴性对照组和空白对照组HCT-116 细胞，参考文献［8］处理后，采用流式细胞仪检测细胞周期。实验中每组各设3 个平行对照。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。计量资料用±s表示，计数资料采用率表示，结肠癌配对组织中SLP-2 蛋白表达的比较采用配对χ2检验，转染SLP siRNA后各组HCT-116 细胞中SLP-2 mRNA和蛋白的表达量以及转染SLP siRNA后各组HCT-116 细胞周期和增殖能力的比较采用方差分析，组间比较用LSD-t检验。检验水准α＝0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SLP-2 蛋白在结肠癌及癌旁正常结肠组织的表达SLP-2在癌旁正常结肠组织中多为阴性或低表达，高表达例数为11例（22.0%），在结肠癌组织中则多呈高表达，高表达例数分别为35例（70.0%）。二者的高表达率差异有统计学意义（χ2＝23.188，P＝0.000），见图1。

2.2 SLP-2 蛋白表达与结肠癌临床病理特征之间的关系 见表1。

表1 SLP-2 的表达与结肠癌临床病理参数的关系（n）

图2 转染48 h 后各组HCT-116 细胞中SLP-2 m RNA的表达

2.3 siRNA的转染及有效时间点的确定 结果显示，转染SLP-2 siRNA序列后，HCT-116 目的基因SLP-2 的表达呈现出明显降低的趋势。从转染后24 h 开始，SLP-2 基因的表达就有所下降，转染后48 h 表达量最低。72hSLP-2 基因表达量有所回升，但仍维持在较低水平。因转染后48 h 后表达抑制率最高，表达降低幅度最大，因此该时间点被选做转染有效时间点。转染48 h后，实验组SLP-2 mRNA表达水平为0.55±0.26，空白对照组为1.42±0.31，阴性对照组为1.35±0.38，3 者比较差异有统计学意义（F＝6.764，P＝0.029），见图2。转染48 h 后，实验组SLP-2 蛋白表达水平为0.61±0.30，空白对照组为1.38±0.42，阴性对照组为1.47±0.35，3 者比较差异有统计学意义（F＝5.171，P＜0.05），见图3。

图3 转染48 h 后各组HCT-116 细胞中SLP-2 蛋白的表达

2.4 转染SLP-2 s i RNA后HCT-116细胞增殖力的变化 MTT法检测结果显示，实验组细胞与阴性对照组和空白对照组比较，增殖力下降（P＜0.05），见表2。

2.5 转染SLP-2 s i RNA后HCT-116 细胞周期的变化 流式细胞仪检测结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3，图4。

表2 SLP-2 siRNA对HCT-116 细胞增殖的 影响（n＝3，±s）

表2 SLP-2 siRNA对HCT-116 细胞增殖的 影响（n＝3，±s）

a：P＜0.05，与实验组比较。

组别 转染后24 h 转染后48 h 转染后72 h 转染后96 h实验组 0.331±0.0280.438±0.0390.636±0.1150.857±0.045阴性对照组 0.353±0.0470.604±0.035a 1.010±0.097a 1.459±0.400a空白对照组 0.341±0.0290.663±0.067a 1.061±0.185a 1.747±0.101a F 0.27917.0058.52510.825 P 0.7660.0030.0180.010

表3 3 组HCT-116 细胞的细胞周期变化（n＝3，±s，%）

表3 3 组HCT-116 细胞的细胞周期变化（n＝3，±s，%）

a：P＜0.05，与实验组比较。

组别 G1期 S期 G2／M期SLP-2 siRNA转染组69.8±2.418.3±2.712.0±1.6阴性对照组 53.6±4.1a 30.9±3.6a 15.3±2.1空白对照组 57.5±3.7a 28.7±5.3a 13.5±3.3

图4 SLP-2 siRNA对HCT-116 细胞周期的影响

3 讨 论

SLP-2 是2000年由美国耶鲁大学病理科首次发现并命名的一个新基因，属于stomatin基因超家族。人SLP-2基因定位于9p13.1，编码长约1500 bp 的mRNA，其编码的蛋白含357 个氨基酸，相对分子质量为3.9 ×103。SLP-2 蛋白是一种细胞膜相关蛋白，可能作为外周膜蛋白起作用，调控离子通道和脂筏结构［1，8］。SLP-2 蛋白还存在于细胞线粒体中，是一种线粒体相关蛋白，可能参与调节与其结合的线粒体膜相关蛋白的稳定性，影响ATP 的合成［7，9］。

近年 来的研究显示，SLP-2基因在食管鳞癌［7，10］、肺 癌［2］、子宫内膜癌［4］、乳腺癌［5，11］、胃癌［3，6］等恶性肿瘤中高表达。且SLP-2 反义基因可抑制某些恶性肿瘤细胞的增殖及转移，促进其凋亡，推测SLP-2 可能促进癌细胞的生长、增殖，抑制癌细胞凋亡，并参与癌细胞的转移［4，7，10］。这些研究表明，SLP-2 可能是一个新的恶性肿瘤相关基因。但目前有关SLP-2 在结肠癌中的表达情况及作用机制的研究较少。

本研究采用免疫组织化学染色发现SLP-2 在结肠癌组织中表达升高，通过分析结肠癌患者的临床病理资料，发现在较晚期、有淋巴结转移的患者中SLP-2 表达升高更为明显。为进一步研究SLP-2 在结肠癌发生发展中的作用，本课题组设计合成SLP-2 siRNA，将其转染结肠癌HCT-116细胞，采用MTT及流式细胞仪检测HCT-116 细胞增殖及细胞周期的变化。结果发现，转染SLP-2 siRNA后，HCT-116 细胞的增殖活性下降，G1期细胞数增多，S期细胞数减少。提示SLP-2 可能通过调节细胞周期促进结肠癌细胞的增殖。

SLP-2 在恶性肿瘤发生发展中的作用机制尚未明确，推测可能与调节细胞信号传导通路及线粒体能量代谢有关。SLP-2蛋白作为一种膜相关蛋白，与细胞信号通路密切相关，可能通过对信号通路的调节参与恶性肿瘤的发生发展。有文献报道，SLP-2 蛋白可能通过与Rho 家族蛋白的相互作用，参与细胞信号传导通路来调节肿瘤细胞的侵袭转移能力［12］。祁代华等［13］的研究也显示，结直肠癌组织中SLP-2 与Rho 家族CDC42 蛋白表达呈正相关，且与结直肠癌的Dukes 分期、淋巴结转移相关。此外，转染SLP-2 siRNA降低Hela 细胞中SLP-2 的表达，可引起线粒体膜电势的降低［9］；转染SLP-2 siRNA降低食管癌KYSE150 细胞中SLP-2 表达后，细胞线粒体膜电势和ATP水平均降低，同时伴细胞运动能力和增殖能力减弱［7］；推测SLP-2可能通过影响细胞的能量代谢参与肿瘤细胞的增殖和转移。目前对SLP-2 的研究不多，对SLP-2 在恶性肿瘤中作用机制的研究仍处于起步阶段，有待进一步深入探索。

本研究发现SLP-2 在结肠癌中表达升高，SLP-2 基因沉默可使HCT-116 细胞被阻滞在G1期，增殖活性降低。该研究结果对阐明结肠癌的发病机制及寻找新的结肠癌治疗分子靶点具有一定意义。

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