滋肾平颤颗粒对异动症大鼠行为学及黑质纹状体DAT和VMAT2基因表达的影响

叶青 周洁 袁灿兴

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

滋肾平颤颗粒对异动症大鼠行为学及黑质纹状体DAT和VMAT2基因表达的影响

叶青 周洁 袁灿兴

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

目的：观察滋肾平颤颗粒对异动症（levodopa-induced dyskinesias，LID）大鼠行为学和黑质纹状体多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）及囊泡单胺转运体2（vesicular monoamine transporter2，VMAT2）基因表达的影响。方法：采用6-羟基多巴胺（6-hydroxydopam ine，6-OHDA）注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病（Parkinson's disease，PD）模型，进一步对PD大鼠予以左旋多巴/苄丝肼制作异动症模型。实验设立正常对照组、模型组、中药干预组、中止给药对照组和中止给药+中药干预组，分别处理或给药1个月后观察药物对LID大鼠异常不自主运动（abnormalinvoluntary movement，AIM）评分的影响，运用实时定量PCR检测黑质纹状体DAT及VMAT2 mRNA表达。结果：与模型组和中止给药对照组比较，中药干预可明显减少异动症大鼠的AIM积分；荧光实时定量PCR结果显示，模型组大鼠DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表达率明显低于正常对照组及其他各组，中药干预组与模型组，中止给药+中药组与中止给药组比较，两种mRNA表达均上调，其中VMAT2增高的趋势更明显。结论：中药可以有效缓解异动症症状，上调DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表达。

异动症 滋肾平颤颗粒 行为学 多巴胺转运体 囊泡单胺转运体2 实验研究

异动症是左旋多巴（levodopa，LD）长期治疗帕金森病过程中普遍出现的并发症，主要表现为舞蹈症和手足徐动症，严重影响帕金森病患者的日常生活质量。目前，各国学者在努力寻找帕金森病（Parkinson's disease，PD）病因的同时将研究重点集中在如下两方面：一是如何阻止或减缓黑质多巴胺能神经元的进行性变性；二是如何减少左旋多巴制剂毒副作用。本研究主要探讨滋肾平颤颗粒对异动症（levodopainduced dyskinesias，LID）模型大鼠行为学和黑质纹状体多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）及囊泡单胺转运体2（vesicular monoamine transporter2，VMAT2）基因表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验药物滋肾平颤颗粒为上海市名中医胡建华教授经验总结方，由熟地黄15g、枸杞15g、桑寄生20g、天麻15g、僵蚕10g、莪术15g、白芍药20g、天南星15g、全蝎3g、蜈蚣3g组成，由江阴天江药业有限公司制成颗粒剂（批号：0504312）。每袋重4.8g，相当于生药32g。将4袋滋肾平颤颗粒（相当于成人l日用量，含生药128g）混合后溶于100mL生理盐水中，使每毫升含生药1.28g。LD粉剂5g（批号：SLD6382）和苄丝肼粉剂5g（批号：SL06492），由美国Sigma公司提供。

1.2 实验动物成年雄性SD大鼠60只，体质量180～220g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号为SCXK沪2003-0002。

1.3 主要试剂和仪器6-羟基多巴胺、阿朴吗啡（apomorphine，APO），美国Sigma公司产品；TaKaRa反转录试剂和荧光定量PCR（F-PCR）反应试剂盒，宝生物工程大连有限公司；DEPC，赛百胜公司；大鼠脑立体定位仪，TOW-3A型，第二军医大学产品；超速离心机，LE80K型，Beckman公司产品；液体闪烁发光记数仪，Wallac1450型，美国PerkinElmer公司产品。IQS多色实时定量PCR检测系统，美国BIO-RAD；Eppendorf核酸蛋白检测仪，德国产。

2 实验方法

2.1 PD大鼠模型制备[1]雄性SD大鼠，在1%戊巴比妥（30mg/kg体重）麻醉下，固定于大鼠脑立体定向仪上，参照包新民等[2]所著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质致密部（SNC）和中脑腹侧被盖部（VTA）三维坐标位置。SNC：前囟后4.8mm，矢状缝右侧2.0mm，硬膜下8.0mm；VTA：前囟后4.8mm，矢状缝右侧1.2mm，硬膜下8.2mm。牙科钻打孔，向两坐标点各注射6-OHDA 6μg（溶于含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中，浓度为2μg/μL），注射速度为1μL/min，留针10min。术后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。术后2周开始行为学检测，应用阿朴吗啡腹腔注射（0.5mg/kg体重），若大鼠恒定转向左侧且旋转圈数＞210r/30m in则视为成功PD模型。

2.2假手术方法用上述同样方法向右侧SNc和VTA分别注射3μL生理盐水（仅含0.2%质量分数的抗坏血酸），术后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素预防感染。

2.3 LID大鼠模型制备[3]对造模成功的PD大鼠予以左旋多巴/苄丝肼处理（10mg/kg左旋多巴和2.5mg/m L苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的消毒生理盐水中），每日10mg/kg，每日2次腹腔注射，连续4周。根据其是否出现异常不自主运动（AIM）包括刻板动作和对侧旋转行为，筛选出LID模型（AIM评分＞20分则视LID造模成功）。

2.4 行为学测试方法（AIM评分测定）各组大鼠均每周1次进行AIM评分[4]。腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后立即评分，每30m in评定1次，持续120m in，共有5组数据，5组数据之和为该次评定结果。将AIM分为4个部分（前肢、口面部、轴性及运动）进行评定，每部分又根据其有或无及严重程度划分为五个等级（0～4分）。0分：无；1分：偶尔出现；2分：经常出现；3分：持续存在，刺激使之停止；4分：持续存在，刺激也不能使之停止。理论上1只大鼠1次用药后的AIM最高评分为64分。

2.5 动物分组与给药54只大鼠造模后经行为学测试，成功造模的LID模型大鼠24只，随机分为模型组、中药干预组、中止给药对照组、中止给药+中药干预组，每组6只。另取6只假手术大鼠为正常对照组。正常对照组及中止给药对照组给予生理盐水灌胃，模型组继续予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射（注射剂量为每千克体质量10mg），中药干预组在模型组处理基础上给予中药灌胃，中止给药+中药干预组则在停用左旋多巴/苄丝肼的基础上加用中药（同中药干预组），每次灌胃量为9mL/kg，1次/d，连续4周。

2.6 大鼠脑组织抽提RNA步骤大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头处死，冰浴中快速剥离大脑，准确切取双侧中脑黑质和尾壳核脑组织，用镊子分别转移到匀浆器中，加入1mL Trizol匀浆，室温5～10min，转入doff管中，加0.2mL氯仿，震荡15min，室温或4℃静置15min，4℃12000g（15000r/min）离心15min，上清转入另一doff管，加入0.5mL异丙醇，-20℃静置15min，4℃12000g（15000r/min）离心10min，去上清，加入1mL 95%乙醇洗涤沉淀，4℃8000g（10000r/min）离心5min，晾干沉淀，加入DEPC水溶解，-20℃保存。

2.7 反转录反应合成引物，每条引物1OD，用于染色法定量PCR。VMAT2 mRNA：F（CCTTCGAAGTCCA CCTGCTAA）；R（CATCACCGATGGGA TATGACTG）。DAT mRNA：F（GCTGC TACATCGGCATCGAG）；R（GTGCCA GCTGCAAAGTGGTC）。反转录反应条件：37℃，15min反转录反应；85℃，5s反转录酶的失活反应。

2.8 FQ-PCR反应条件定量PCR仪测定各组mRNA相对含量。0.05min→95℃，0.05min→Tm，0.2min→72℃，0.1min→72℃，5min（Tm：B-action-STR 61.6℃，B-actionSN 61.4℃，DAT 60.9℃，VMAT2 57.4℃）。按照FQ-PCR间接定量公式计算：平均相对含量（%）=2平均△△Ct，△△Ct=△Ct样本-△Ct对照，△Ct样本=△Ct样本-△Ct内参。

3 实验结果

3.1 各组大鼠给药前后神经行为学（AIM评分）的变化见表1。与用药前（第0周）比较，模型组大鼠用药后第1、2、3和4周的AIM评分逐步升高。与同期模型组比较，中药干预组大鼠第1周AIM评分差异无统计学意义，自第2周开始下降，第3和4周的AIM评分值明显降低（P＜0.01）。中止给药对照组大鼠第2、3和4周AIM评分明显低于同期模型组（P＜0.01）。中止给药+中药干预组大鼠AIM评分自第2周开始低于同期中止给药对照组（P＜0.01）。

3.2 各组大鼠治疗后损毁侧黑质纹状体DAT、VMAT2 mRNA相对表达量比较见表2。FQ-PCR结果计算后经由Excel软件套用公式分析，得到各组大鼠黑质纹状体DAT及VMAT2 mRNA的相对表达量。从表2可以看出，治疗4周后各组大鼠DAT mRNA的表达量均较正常对照组明显降低（P＜0.01）；中药干预组较模型组，中止给药+中药干预组较中止给药对照组，DAT mRNA的表达量均明显增高（P＜0.01）。模型组、中药干预组、中止给药对照组大鼠VMAT2 mRNA的表达量均较正常对照组明显降低（P＜0.05，P＜0.01），中止给药+中药干预组VMAT2 mRNA的表达量较正常对照组明显升高（P＜0.01），中药干预组较模型组，中止给药+中药干预组较中止给药对照组，VMAT2 mRNA的表达量均明显升高（P＜0.01）。

表1 各组大鼠不同时期AIM评分变化情况（±s）

表1 各组大鼠不同时期AIM评分变化情况（±s）

注：与第0周比较，**P＜0.01；与同期模型组比较，△△P＜0.01；与同期中止给药对照组比较，##P＜0.01。

组别动物数（只）第0周模型组第1周6 35.02±3.11第2周第3周38.76±3.61**第4周47.71±10.75**50.38±7.29**53.44±5.34**6 34.18±6.54中止给药对照组6 33.17±9.59 27.98±8.72 26.60±7.69△△19.40±4.32△△14.38±3.34△△中止给药+中药干预组6 33.26±7.32 27.76±17.02 12.76±6.53##7.05±3.33##4.76±3.05##中药干预组37.05±10.45 41.16±7.12 31.19±2.13△△26.19±2.12△△

表2 各组大鼠损毁侧黑质纹状体DAT、VMAT2 mRNA相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠损毁侧黑质纹状体DAT、VMAT2 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与中止给药对照组比较，##P＜0.01。

组别动物数（只）DAT mRNA VMAT2 mRNA 0.25±0.02**中药干预组6 0.23±0.03**△△0.88±0.16*△△中止给药对照组6 0.33±0.05**0.43±0.04**中止给药+中药干预组6 0.58±0.13**##1.59±0.26**##模型组60.09±0.01**

4 讨论

DAT是位于多巴胺（dopamine，DA）能神经元突触前膜上的一种膜蛋白，其主要功能是再摄取突触间隙中的DA进入DA能神经元，终止DA的神经传递[5]。Counihan等[6]在PD患者脑内也观察到DAT mRNA在黑质致密部的表达较对照组减少50%，在黑质纹状体通路减少43%，表明DAT是研究PD发病机制的一个重要的参考指标。有体外实验显示：左旋多巴不仅对D8细胞（产生DAT的细胞）有毒性损害，还能使DAT数量明显减少[7]。这一现象在我们的实验中从mRNA水平得到证实。接受治疗的LID模型大鼠，其DAT mRNA的表达量与正常大鼠比较都有较大程度的下降，模型组表达量几乎为零，运用中药协同治疗后，DAT mRNA的表达有明显上升。

VMAT2为DA能神经元突触末稍内单胺递质囊泡膜上的转运体，负责将DAT转运入细胞内的DA转运入囊泡并调节随后的释放，VMAT2通过携带DA进入突触囊泡和调节随后的释放而在DA的储存与释放中起关键作用。另外，VMAT2对细胞内毒素的清除也起着非常重要的作用，通过将毒物清除入囊泡而防止对神经元的毒性作用。Miller等[8]研究发现，在PD小鼠纹状体区VMAT2结合位点明显减少，在黑质致密部的mRNA表达也同样减少，而且在PD患者的脑内也观察到VMAT2的含量减少，表明VMAT2也是反映PD损害的一个重要指标。在LD替代治疗过程中，如能适当地增强VMAT2功能或表达，使外源性LD在脑内迅速转化为多巴胺后发挥最大效应，减少用量以减轻其毒副作用。另外可增加多巴胺的释放，促进多巴胺的转运，提高多巴胺的利用率以减少自由基的产生，减轻体内抗氧化系统的压力，减少残存神经元的变性，达到有效的远期治疗效果[9]。实验中我们发现，除了VMAT2 mRNA在中止给药+中药干预组中有较高的表达，甚至超出了正常大鼠的表达水平之外，其他3组的VMAT2 mRNA表达量与正常对照组相比均有明显下降。但较之模型组，中药干预组的VMAT2 mRNA表达也有明显提高。VMAT2 mRNA检测的是与检测DAT mRNA相同的黑质纹状体区域。相比较之下，我们可以看出，在同样等级数的黑质纹状体多巴胺能神经元中，中止给药+中药干预组VMAT2 mRNA的表达比例较之DAT mRNA远远升高，中药干预组的VMAT2 mRNA表达比例与DAT mRNA的差异也很明显。从这一结果我们可以推测，中药有促进黑质多巴胺能神经元表达VMAT2的作用。这可以有效地缓解游离DA在胞体中的含量，恢复多巴胺能神经元末梢储存与释放多巴胺的能力即缓冲能力，从而缓解异动症症状。

滋肾平颤颗粒是已故上海市名老中医胡建华教授基于中医理论，并参考民间验方及中医文献，经过数十年临床反复摸索与验证，提炼出治疗帕金森病的经验总结方。胡教授认为，帕金森病的病变部位主要在肝、脾、肾，且以肝、肾为中心，病机为本虚标实。“虚”则指肝肾亏损，脏腑功能失调；“实”则指风、火、痰、瘀互结，蕴塞脑窍。治疗当以滋补肝肾、通络解毒为基本方法。本方标本兼治，重用熟地、枸杞、桑寄生滋补肝肾，治“风”之由，再用白芍养肝柔肝、熄风止痉，天麻平肝熄风，僵蚕、全蝎、蜈蚣搜风剔络，天南星化痰制痉，莪术破血除瘀。

本实验结果表明，中药可以有效缓解异动症症状，上调DAT尤其是VMAT2基因的表达，促进神经元中突触囊泡转运或转运体在膜上表达的功能，具有神经保护作用。DAT功能的改善有利于多巴胺的再吸收利用；保护VMAT2的功能有利于多巴胺的储存和再释放，使多巴胺神经元得到保护，从而可能提高DA利用率，起到治疗PD的作用。

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R742.5

A

1672-397X（2014）04-0074-03

叶青（1982-），男，博士研究生，主治医师，研究方向：中西医结合治疗帕金森病。

袁灿兴，ycanxing@hotmail.com

2013-12-23

编辑：吴宁

国家自然科学基金青年项目（81302926）；上海市中医药事业发展三年行动计划（ZYSNXD-CC-HPGC-JD-003）