固相萃取技术在复方草珊瑚含片中异嗪皮啶定量分析中的应用研究

包建民，高赫男，王琨，李优鑫

(天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津化学化工协同创新中心，天津大学药物科学与技术学院，天津 300072)

固相萃取技术(SPE)是利用目标成分与其它成分在固定相上保留方式和能力的不同，达到分离、富集、纯化的目的。主要优点是能处理低浓度试样;操作简单快速，便于自动化;分离时间短;富集倍数高;有机溶剂的低消耗;方便试样的储存和运送等［1］。在环境、食品、医药等领域［2-5］，逐渐取代传统方法，获得广泛应用。目前，在美国、欧洲等发达国家，SPE已被列入行业标准［6-9］，基本取代传统的预处理方法。

中药制剂剂型多样、样品成分复杂、有效成分含量低、杂质较多，使得中药制剂的含量测定存在干扰多、方法专属性和重复性不佳等问题，同时，容易污染仪器，降低仪器的使用寿命。因此，中药制剂的预处理技术一直是中药研究的重要内容之一。

本文选取药典［10］收载的采用液-液萃取预处理方法的复方草珊瑚含片作为研究对象，在药典方法基础上，建立基于SPE预处理技术的含量测定方法，并进行系统的方法学考察。通过与药典方法的比较，评价SPE技术用于此药品预处理的实用性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

异嗪皮啶标准品(中国药品生物制品检定所，批号110837-200304);江中牌复方草珊瑚含片(生产批号0512018);甲醇、乙腈均为色谱纯;蒸馏水。

Waters 600s型高效液相色谱仪(包括616型泵，717型自动进样器，486型紫外检测器);DL-180A超声清洗器;AL-104电子分析天平;SPE-C18小柱。

1.2 色谱条件

色谱柱 Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1% 磷酸水溶液(12.5∶87.5)，流速1 mL/min，检测波长340 nm，柱温室温，进样量 20 μL。

1.3 对照品溶液的配制

精密称取一定量的标准品，加甲醇，制成38 μg/mL的对照品溶液，进一步稀释，得一系列浓度的对照品溶液。

1.4 样品液的配制

1.4.1 药典法 按照2005年版中国药典规定方法进行处理。取本品10片，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，加水约10 mL，超声处理(功率300 W，频率25 kHz)10 min，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷振摇提取5次，每次10 mL，离心收集合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，残渣用甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

1.4.2 SPE 法

1.4.2.1 提取 复方草珊瑚含片研磨，过7#筛。精密称取粉末0.80 g，精密加水8 mL，超声处理30 min，离心3 min，转速11 000 r/min，合并上清液。

1.4.2.2 固相萃取 取上清液1.0 mL，过 SPE 柱(经5 mL甲醇和5 mL水洗)用 10 mL水淋洗、5 mL 10%甲醇淋洗，以5 mL 50%甲醇洗脱，收集洗脱液，定容至 5.0 mL。经 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 系统适应性实验及色谱条件优化

根据分离度和保留时间，优化流动相中磷酸和乙腈的浓度，确定流动相为乙睛∶0.1%磷酸=12.5∶87.5。

取样品液，按1.2节进行系统适应性实验，重复进样4次，色谱图见图 1，考察理论塔板数为34 000 块/m，拖尾因子0.97，分离度为 2.4，RSD 为0.6%。处理后得到的样品杂质成分简单，有效成分含量高。

图1 标准品和样品液色谱图Fig.1 Chromatogram of standard and sample after SPE treatment

2.2 SPE洗脱条件优化

按1.4.2节处理样品，分别用5 mL不同浓度的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集水洗液和洗脱液，优化洗脱条件。结果表明，5%，10%甲醇洗脱液中都检测不到异嗪皮啶的色谱峰，15% ～50%甲醇洗脱液中都能检测到异嗪皮啶谱峰。因此，采用将样品通过活化的 SPE小柱后，依次用10 mL水和5 mL 10%甲醇淋洗，最后用5 mL 50%甲醇洗脱，定容至5 mL进行HPLC分析。

为了让异嗪皮啶尽可能完全保留在SPE柱上，且便于操作，同时又不使所得溶液浓度过稀，影响检测，故上样1 mL。为了保证异嗪皮啶完全洗脱下来，并且为了换算方便，选用5 mL 50%甲醇洗脱。

2.3 提取条件的优化

根据药典方法，常温下10 mL水超声提取，且超声过程中温度会升高，故不再考虑提取温度和提取溶剂的影响，研磨后过7#筛，消除粒径的影响。所以本文着重考虑提取时间的影响。

按1.4.2 节处理样品，分别超声处理 10，15，20，30 min，记录峰面积，根据提取的效果以及稳定性，超声30 min结果最佳，故选用超声时间为30 min。

2.4 绘制标准曲线

取对照品溶液，逐级稀释得 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0 μg/mL 一系列浓度的溶液，分别进样20 μL，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，异嗪皮啶浓度为横坐标作图，拟合回归得回归方程y=68 666x－7 046.1，相关系数 R2=0.999 6，线性范围0.5 ～8.0 μg/mL。

2.5 精密度实验

2.5.1 重复性 取药典方法和SPE法制得的样品液，分别进样20 μL，重复3次，计算异嗪皮啶含量和日内RSD(见表1)，SPE法日内精密度优于药典方法。

2.5.2 日间精密度 分别于第1，3，5 d重复此实验，计算日间RSD，结果见表1。结果表明，本方法重复性符合分析要求。

由表1可知，药典方法测得的异嗪皮啶含量略小于SPE方法，主要原因是药典方法在样品超声处理后将混合物多次萃取处理，难免造成异嗪皮啶的损失;而SPE方法在样品超声处理后直接离心，上样，没有进行反复萃取处理，故减少了异嗪皮啶的损失。

表1 药典方法和SPE方法的精密度Table 1 Precision of pharmacopoeia method and SPE method

2.6 回收率

2.6.1 绝对回收率 取1.96 μg/mL的对照品，按1.4.2.2节处理，记录峰面积，重复 3次，计算绝对回收率为99.6%，表明所用SPE柱符合要求。

2.6.2 加样回收率 按1.4.2.1节处理样品，分别精密加入对照品适量，按1.4.2.2节实验，同时做平行实验，计算加样回收率，结果见表2。

表2 异嗪皮啶的加样回收率Table 2 Recoveries of isofraxidin

由表2可知，平均加样回收率在96.1% ～101.1%，表明分析方法准确。

3 结论

将固相萃取方法应用到中药复方制剂的前处理中，建立了基于固相萃取的复方草珊瑚含片含量测定方法，该方法分析准确、重复性好、系统适应性高、除杂干净、对检测系统的污染少、与药典方法比较，操作简便快捷，避免了重复提取和高毒性有机溶剂氯仿的使用，整个前处理过程中所用有机溶剂少，环境友好。

［1］Fan Huixia，Deng Zhipeng，Zhong Hao，et al.Development of new solid phase extraction techniques in the last ten years［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Science，2013，22(4):293-302.

［2］Liu Xiaodan，Yu Yingjia，Zhao Meiyan，et al.Solid phase extraction using magnetic core mesoporous shell microspheres with C18-modified interior pore-walls for residue analysis of cephalosporins in milk by LC-MS/MS［J］.Food Chemistry，2014，150:206-212.

［3］Cai Baodong，Zhu Jiuxia，Shi Zhiguo，et al.A simple sample preparation approach based on hydrophilic solid-phase extraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of endogenous cytokinins［J］.Journal of Chromatography B，2013，942-943:31-36.

［4］Kazuhiko Takeda，Makoto Moriki，Wakako Oshiro，et al.Determination of phenolic concentrations in dissolved organic matter pre-concentrate using solid phase extraction from natural water［J］.Marine Chemistry，2013，157:208-215.

［5］Wang Rong，Wang Xin，Liang Chen，et al.Direct determination of diazepam and its glucuronide metabolites in human whole blood by μElution solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Forensic Science International，2013，233:304-311.

［6］EN 16278—2012 Animal feeding stuffs-determination of inorganic arsenic by hydride generation atomic absorption spectrometry(HG-AAS)after microwave extraction and separation by solid phase extraction(SPE)［S］.German:EN，2012.

［7］ANSI/ASTM D6889—2003 Practice for screening for volatile organic compounds in water using solid phase Microextration(SPME)［S］.America:ANSI，2003.

［8］DIN EN 14524—2004 Foodstuffs-determination of okadaic acid in mussels-HPLC method with solid phase extraction clean-up，derivatization and fluorimetric detection［S］.German:EN，2004.

［9］ASTM D7168—2005 Standard test method for99Tc in water by solid phase extraction disk［S］.America:ASTM，2005.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.一部.北京:化学工业出版社，2005:533.