流动注射-化学发光法测定氯霉素

马明阳

(西安文理学院化学与化学工程学院，陕西西安 710065)

氯霉素是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素，对很多不同种类的微生物均起作用。它价钱低廉，广泛用于治疗各种敏感菌感染。但是，长期微量摄入氯霉素，不仅使沙门菌和大肠杆菌产生耐药性，还会引起机体正常菌群失调，引发各种疾病，从而对人类健康构成潜在威胁。因此，对氯霉素的灵敏检测具有十分重要的意义。

目前，测定氯霉素的方法主要有:高效液相色谱法［1-2］、气相色谱法［3］、气相色谱-质谱联用法［4］、免疫法［5］、紫外分光光度法［6］、荧光法［7］和毛细管电泳法［8］等。实验发现，氯霉素对H2O2-鲁米诺化学发光体系有增敏作用，据此，结合流动注射分析，建立了灵敏检测氯霉素的化学发光分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯霉素(中国药品生物制品检定所);鲁米诺;NaOH、H2O2、KMnO4等均为分析纯;蒸馏水。

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪;IFFS-A型多功能化学发光检测器。

1.2 溶液配制

1.2.1 鲁米诺储备液(1.0 ×10－2mol/L)的配制用10 mL 1.0 mol/L的氢氧化钠溶液溶解1.77 g鲁米诺，定容于1 000 mL容量瓶中作为储备液，使用时用氢氧化钠溶液稀释至所需浓度。

1.2.2 标准溶液(1.00 ×10－3g/mL)的配制 准确称取0.100 0 g氯霉素，用蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中，使用时用水逐级稀释至所需浓度。

1.3 实验方法

流动注射化学发光反应装置如图1所示。a为待测液(药品)，b为H2O2溶液，二者先混合，c为鲁米诺溶液，流入进样阀中，再与a、b混合液混合。三者流入流通池内，产生化学发光。采样时间和进样时间均为20 s，选择高压为500 V，泵速为30 r/min(进样管内径为0.8 mm，流路流速相当3 m/min)，以峰高进行定量。

图1 流动注射化学发光分析仪流程图Fig.1 Schematic diagram of CL flow system

2 结果与讨论

2.1 测定条件的选择

2.1.1 流路选择 可供选择的流路有3种:①氯霉素和KMnO4先混合，再注入鲁米诺(NaOH)溶液中;②氯霉素和鲁米诺(NaOH)先混合，再注入KMnO4溶液中;③KMnO4和鲁米诺(NaOH)先混合，再注入氯霉素溶液中。通过对以上流路的化学发光实验，发现氯霉素在①中发光信号信噪比最大。因此，选定流路①作为流动注射发光实验中的最佳流路。

2.1.2 氧化剂的选择 对 KMnO4、H2O2、K2Cr2O7、K3Fe(CN)6逐一进行化学发光实验，综合考虑信噪比和样品的相对发光强度两个条件，确定H2O2为最佳氧化剂。

2.1.3 H2O2浓度的选择 H2O2作为H2O2-鲁米诺化学发光体系中的氧化剂，在 1×10－2～1×10－4mol/L范围内，考察H2O2浓度对反应化学发光强度的影响，以最大信噪比作为依据。结果表明，H2O2最佳浓度为6.0 ×10－4mol/L。

2.1.4 鲁米诺溶液中NaOH浓度的选择 在碱性条件下，H2O2氧化鲁米诺产生化学发光，介质的碱度影响化学发光法信号。考察了1.0×10－2～1.0×10－6mol/L范围内NaOH的浓度对化学发光信号的影响。结果表明，当鲁米诺中NaOH的浓度为8.0×10－5mol/L时，检测到的化学发光具有最大的信噪比。

2.1.5 鲁米诺浓度的选择 鲁米诺作为发光试剂，在1.0×10－3～1.0×10－6mol/L 范围内考察了鲁米诺浓度对体系化学发光信号的影响。结果表明，当浓度为1.0×10－4mol/L时，化学发光检测具有最大的信噪比。

2.1.6 混合管长度的选择 混合管的长度影响氯霉素和H2O2反应的完全程度，从而影响化学发光强度。若混合管太短，则氯霉素和H2O2反应不充分，混合管太长，则测量既费时间又费溶液。对混合管的长度在2～40 cm范围内进行了选择。以最大信噪比作为最佳长度判断依据，选择混合管长度为5 cm。

2.2 校准曲线、精密度和检出限

在实验选定的最佳条件下，为了提高测定的准确度，校准曲线分段绘制，氯霉素的质量浓度在2.0×10－7～8.0×10－6g/mL 范围时，浓度与其发光强度呈良好的线性关系，校准曲线的基本参数列于表1。

表1 校准曲线的基本参数Table 1 The basic parameters of the calibration curve

11次平行测定5.0×10－7g/mL的氯霉素化学发光信号，方法的相对标准偏差为1.3%。方法的检出限为5×10－8g/mL。

2.3 共存物质的影响

在优化的最佳实验条件下，对5×10－7g/mL氯霉素进行干扰实验。结果表明，相对误差小于5%时，1 000倍的 N、淀粉不干扰，500 倍的 Cl－、S、葡萄糖、麦芽糖不干扰;100倍K+不干扰;等倍的C、Cu2+不干扰。

2.4 样品分析

准确称量10粒氯霉素胶囊，去皮后，称取相当于1粒的量，用超纯水溶解后定容至250 mL容量瓶中。准确移取一定体积该溶液，并用微孔滤膜过滤后稀释至适宜浓度，用本方法定量测定胶囊中的氯霉素，同时做回收率实验，结果见表2。

表2 氯霉素胶囊的测定结果和回收率Table 2 Determination results and recovery of chloramphenicol capsules

3 结论

基于氯霉素对H2O2-鲁米诺化学发光体系的增敏作用，建立了流动注射化学发光分析方法检测氯霉素的新方法。最佳实验条件:流路选择氯霉素和KMnO4先混合，再注入鲁米诺(NaOH)溶液中;氧化剂选择 H2O2，其浓度为 6.0 ×10－4mol/L;鲁米诺中NaOH的浓度为 8.0×10－5mol/L;鲁米诺浓度为1.0×10－4mol/L;选择混合管长度为5 cm。在选择的最佳条件下，该方法检测氯霉素的检出限(3σ)为5×10－8g/mL，对5×10－7g/mL氯霉素进行 11次平行测定，相对标准偏差(RSD)为1.3%，加标回收率在95%～105%。并用该方法对氯霉素胶囊中氯霉素的含量进行了测定。

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［8］封宇飞，姜文清，郭郁，等.毛细管区带电泳法测定氯霉素滴眼液的含量及降解产物二醇物的控制［J］.中国药学杂志，2002，37(5):365-367.