组蛋白H3K4甲基转移酶复合物亚基Ash2参与裂殖酵母产孢

王文超，周欢，余垚，吕红

1. 复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海 200433

2. 上海市工业菌株工程技术研究中心，上海 200433

组蛋白H3K4甲基转移酶复合物亚基Ash2参与裂殖酵母产孢

王文超1,2，周欢1,2，余垚1,2，吕红1,2

1. 复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海 200433

2. 上海市工业菌株工程技术研究中心，上海 200433

在氮源缺乏及信息素存在的条件下，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)进行减数分裂并完成产孢。在此过程中，信息素介导的MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信号通路调控减数分裂相关基因的表达。Spk1是MAPK通路的核心成员，通过蛋白磷酸化的方式激活转录因子Ste11，从而激活mei2+、mam2+和map3+等减数分裂相关基因的表达。尽管组蛋白H3K4甲基化参与基因转录激活、染色质重塑等诸多生物学过程，但其在裂殖酵母产孢过程中的作用并不清楚。文章通过序列比对，发现裂殖酵母Ash2作为H3K4甲基转移酶复合物COMPASS的亚基具有两个保守的结构域，定位于细胞核内参与H3K4的甲基化修饰。ash2+的缺失引起裂殖酵母在氮源缺乏时产孢过程的延迟及产孢率下降。ChIP、定量PCR分析结果显示，ash2+的缺失降低了spk1+编码区H3K4的二甲基化水平，造成spk1+mRNA水平的明显下调。在ash2Δ细胞中，虽然ste11+的转录水平没有变化，但Ste11的靶基因mei2+、mam2+和map3+的转录水平明显下降。在裂殖酵母中，组蛋白H3K4甲基转移酶复合物COMPASS的亚基Ash2通过调控二甲基化水平修饰从而调节MAPK信号通路，参与裂殖酵母的有性生殖，为建立表观遗传修饰与减数分裂之间的联系提供了新的线索。

裂殖酵母；H3K4甲基化；Ash2；产孢；MAPK

在适宜环境中，裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以有丝分裂的方式进行无性繁殖。与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在营养丰富的条件下发生细胞接合的情况不同，裂殖酵母只有在环境营养缺乏尤其是氮源缺乏时，才能发生细胞接合。细胞接合发生在具有相反交配型的h+和h-细胞之间，产生二倍体合子。合子进行减数分裂并产生 4个单倍体孢子，孢子等待适宜的环境进行萌发[1]。裂殖酵母从有丝分裂进入减数分裂的过程被多条信号途径所操纵，其中包括信息素介导的 MAPK(Mitogenactivated protein kinases)信号转导途径。MAPK途径是由膜上的G蛋白耦联受体和一系列蛋白激酶所构成的经典级联信号传导途径。通常情况下，G蛋白耦联受体接受外界信号，激活胞浆中MAPKK激酶(MEKK)，MEKK通过磷酸化激活MAPK激酶(MEK)，然后MEK通过磷酸化激活MAPK。激活的MAPK进入细胞核内，通过磷酸化激活转录因子，起始相关基因表达，从而对外界信号做出回应[2]。裂殖酵母信息素途径主要由Map3/Mam2(G蛋白耦联受体)、Byr2(MEKK)、Byr1(MEK)和Spk1(MAPK)组成。在氮源缺乏的情况下，h+和 h-细胞分泌信息素，信息素被Map3或Mam2识别，随后Byr2、Byr1和Spk1被依次激活。Spk1通过磷酸化激活转录因子Ste11[3]，Ste11随后激活交配型基因matP+、matM+和减数分裂必需基因 mei2+的转录[4,5]，从而诱导细胞对氮源缺乏的环境做出应答，启动细胞接合以及下游的减数分裂过程。对于MAPK途径的调控存在多种方式，例如：通过改变蛋白激酶的构象来影响其磷酸化能力，如调节因子Ste4与Byr2(MAPKKK)直接结合，通过影响Byr2二聚体的形成来调节MAPK途径[6]；此外，通过改变蛋白激酶的胞内定位来影响它的磷酸化，如14-3-3家族蛋白Rad24和Rad25与Byr2结合，促进 Byr2从胞浆定位到质膜，从而实现Map3/Mam2(GPCR)对Byr2的磷酸化[7]。通过影响蛋白激酶的转录水平调控MAPK通路的研究相对较少。

COMPASS是一个在真核生物中高度保守的蛋白复合物，通过调节基因的转录表达，在应激、凋亡、发育等生物学过程中发挥了重要作用。COMPASS的核心亚基为Set1，具有组蛋白H3K4的甲基化转移酶活性[8]，参与组蛋白 H3K4一甲基(me)、二甲基(me2)和三甲基(me3) 3种层次的修饰[9]，其中酵母中H3K4二甲基化主要分布于基因编码区域，参与基因的转录调节[10,11]。除了 Set1，COMPASS复合物还包括多个重要的亚基，如Ash2、RBBP5、WDR5和hDPY30等[12]。研究发现，COMPASS复合物的亚基参与了产孢过程的调控。例如，在酿酒酵母中，COMPASS复合物酶学亚基Set1的缺失延缓了减数分裂期间的DNA复制，从而导致产孢效率的下降，该调节过程并不依赖 COMPASS的甲基化酶活性[13]。COMPASS亚基Spp1可以与DNA双链断端(DSB)蛋白Mer2直接结合，促进了DSB的形成和减数分裂重组，推动了产孢过程[14]。上述研究结果提示，COMPASS复合物采用了多种机制参与调控产孢过程。

Ash2(Absent, small, or homeotic discs 2)属于trithorax-group (trxG)家族，在进化上相当保守，很多真核生物中都拥有 Ash2的同源蛋白。在果蝇(Drosophila melanogaster)中，ASH2的缺失突变降低了发育相关基因启动子区域的 H3K4三甲基化，从而影响了该基因的转录激活，造成果蝇翅膀的缺刻的变化[15]。果蝇的ASH2可以与SKTL(磷脂酰肌醇4-磷酸-5激酶)直接结合，两者的同时缺失会引起多线染色体中H1的过磷酸化[16]。ASH2L是Ash2的人类同源蛋白，它在胚胎早期发育和心脏发育中起到重要作用[17]。ASH2L也是一个原癌基因，它的表达异常与肿瘤的发生密切相关。在酿酒酵母中，Ash2同源蛋白BRE2作为COMPASS复合物的亚基，定位于细胞核中，调控组蛋白H3K4的甲基化修饰[9]。相对于其他物种，裂殖酵母Ash2的功能研究还很少。

本研究发现 ash2+缺失会引起裂殖酵母产孢缺陷，通过荧光定位和Western blot发现Ash2定位于细胞核内参与 H3K4甲基化修饰。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)和定量 PCR揭示了 Ash2通过调控MAPK途径成员的转录水平，影响了MAPK途径靶基因的表达。本研究为建立表观遗传修饰与减数分裂之间的联系提供了新的线索。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所使用的裂殖酵母菌株见表 1。E. coli DH5α为本实验室保存。用于产孢研究的野生型菌株h90的基因座上有两种交配型基因，可以在繁殖过程中表现出h+或是h-的性状，正常环境中，h90菌株进行无性生殖，当环境中氮源缺乏时，在细胞群落中h90可以进行同宗交配[18]。裂殖酵母基因同源敲除质粒CHGL、红色荧光整合质粒FAML均为本实验室构建及保存。两种质粒均通过改造pCloneHyg1质粒获得，带有潮霉素抗性序列(HygR)筛选标记。酵母的常规培养基YES及培养条件参见文献[18]，酵母接合产孢培养基EMM-N配方参见文献[19]。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除菌株及荧光菌株构建

采用同源重组的方式在h90菌株中敲除ash2+。用于扩增ash2+上游同源区域引物对为Ash2-KO-Up-F/ Ash2-KO-Up-R，扩增下游同源区域引物对为 Ash2-KO-Down-F/Ash2-KO-Down-R，用于验证敲除的上游引物对为up5'/CR，下游引物对为CF/dw3'。构建流程图见图1。PCR分别扩增裂殖酵母ash2+的上游序列(up)和下游序列(dw)，并引入图示酶切位点。将up片段和dw片段双酶切后分别装入pCHGL敲除质粒，获得用于中断ash2+的质粒pCHGL-Ash2，将质粒用SalⅠ单酶切线性化后转入野生型h90菌株中，上下游序列将与基因组上的同源区域发生同源重组，使ash2+被潮霉素抗性基因中断盒(hphMX4)所替换。随后利用潮霉素筛选阳性转化子。通过类似的同源重组策略在 ash2+3′端融合红色荧光蛋白(RFP)标签，获得了表达 Ash2-RFP融合蛋白的菌株。用于扩增融合区域上游同源区域的引物对为 Ash2-RFPUP-F/Ash2-RFP-UP-R，扩增下游同源区域的引物对为Ash2-RFP-DW-F/Ash2-RFP-DW-R。引物信息见表2。

表1 本研究使用的裂殖酵母菌株

图1 ash2+缺失突变体的构建流程

表2 引物序列

1.2.2 显微镜观察

将 WC2(Ash2-RFP)培养至对数生长期(OD600= 1.0左右)进行活细胞观察，利用IX51基础型倒置显微镜(Olympus公司)的微分干涉(DIC)明场观察酵母细胞形态，利用WIGA通道观察Ash2-RFP红色荧光信号，利用WU通道观察Hoechst的信号。采用DP2-BSW软件拍摄及分析细胞图片。

1.2.3 裂殖酵母组蛋白抽提

将F274(wt)、LHP2(ash2Δ)和LHP3(set1Δ)分别接种于50 mL YES液体培养基中，32℃培养至OD600大于 1.0。离心收集菌体后，用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的NIB buffer(0.25 mol/L蔗糖、60 mmol/L KCl、15 mmol/LNaCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、15 mmol/L Pipes，pH6.8、0.8% Triton X-100)重悬。采用玻璃珠震荡破碎菌体，加入 500 μL 0.4 mol/L H2SO4，静置1 h。离心取上清，加入12倍体积的预冷丙酮沉淀蛋白。离心收集沉淀并风干，用100 μL 4 mol/L尿素重悬沉淀，加入6×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳，用anti-H3K4me、anti-H3K4me2和anti-H3K4me3抗体进行Western blot检测，用anti-H3检测作为内参。

1.2.4 产孢效率检测

为了检测在液体培养基中的产孢效率，将LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接种于YES中，生长至对数生长期中期。使用EMM-N将菌体洗涤3次后转接至50 mL EMM-N液体培养基，初始OD600=0.2。每4 h取样进行产孢效率的统计，并绘制产孢曲线。产孢效率计算公式参考文献[6]。

为了检测在固体培养基上的产孢效率，将野生型LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接种于YES中生长至对数生长期中期，使用EMM-N将菌体洗涤3次。将菌液浓度调至 OD600=1，取 5 μL菌液点种于EMM-N固体培养基上。25℃培养3 d后，用碘蒸汽对孢子进行染色，使用奥林巴斯IX51倒置显微镜拍摄，并统计产孢效率，产孢效率计算公式参考文献[6]。

1.2.5 RNA提取及定量PCR

将LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接种于YES中培养至对数生长期，用EMM-N清洗菌体3次，转接至50 mL EMM-N培养基中，初始OD600=0.2，25℃培养12h。离心收集细胞(约1×108个)，采用酵母RNA抽提试剂盒(Ambion)抽提 RNA，利用反转试剂盒(TaKaRa)进行RT-PCR反应，随后采用SYBR premix Ex-Taq (TaKaRa)和 LightCycler480(罗氏)进行定量PCR分析，以 act1+作为内参。定量 PCR所用引物的序列参见表2。

1.2.6 染色质免疫共沉淀(ChIP)

将LHP1(h90)和WC1(h90ash2Δ)接种于YES中培养至对数生长期，用EMM-N清洗菌株3次，转接至50 mL EMM-N培养基中，初始OD600=0.2，25℃培养12 h后，离心收集细胞(约3×108个)。用1%的甲醇在25℃固定20 min，加入终浓度为150 mmol/L的甘氨酸终止固定。收集细胞，用Buffer I (50 mmol/L HEPES (pH7.5)、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% TritonX-100和0.1% Na-deoxycholate)清洗两次后，用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的Buffer I重悬菌体。用玻璃珠振荡器破菌。用超声破碎仪在冰上对裂解液处理15 min打断DNA。对裂解液离心后取上清，采用EZ-Magna ChIP试剂盒(Millipore)进行ChIP，所用抗体为anti-H3K4me2(Millipore 05-1338)。利用Real-time PCR对ChIP所得到的DNA进行分析，以fbp1+作为内参，所用引物的序列参见表2。

2 结果与分析

2.1 裂殖酵母Ash2蛋白的结构域分析

裂殖酵母ash2+基因位于II号染色体，编码区全长1959 bp。SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在线分析结果显示，Ash2含有两个重要的结构域，分别位于42～92位氨基酸的PHD结构域和330～519位氨基酸的SPRY结构域(图2A)。利用DNAMAN软件对酿酒酵母、裂殖酵母、果蝇(D.melanogaster)、小鼠(M.musculus)及人类(H.sapiens)的 Ash2同源蛋白进行了全长序列比对。结果显示，Ash2同源蛋白中均含有保守的锌指PHD和SRPY结构域(图2B，黑框)，两个结构域可能发挥了保守的生物学功能。

2.2 裂殖酵母ash2+缺失突变体的构建

为了研究裂殖酵母Ash2的功能，本研究利用同源重组的方法在 LHP1(h90)菌株中构建了 ash2+的缺失突变体。利用图1所示的up5'/CR和CF/dw3'两对引物对获得的阳性转化子进行PCR鉴定，结果表明ash2+被含有潮霉素抗性基因的中断盒所替换(图 3)，从而获得了ash2+缺失突变体菌株WC1(h90ash2Δ)。

2.3 裂殖酵母Ash2的定位及对 H3K4甲基化修饰的影响

为了探究在裂殖酵母Ash2蛋白是否参与H3K4的甲基化修饰，本研究首先检测了Ash2在细胞内的定位。采用同源重组策略，在裂殖酵母野生型菌株wt的ash2+基因座位的C端融合了RFP，获得了表达内源性的 Ash2-RFP荧光蛋白的菌株 WC2 (Ash2-RFP)。荧光显微镜观察结果表明，Ash2主要分布在细胞核内(图4A)。

比较了野生型细胞wt和ash2Δ细胞中的H3K4一、二、三基化修饰水平，以组蛋白 H3K4甲基转移酶复合物核心酶学亚基Set1作为对照。结果表明，当ash2+缺失时，H3K4me3水平完全丧失，H3K4me2水平相比于野生型明显降低。作为对照，COMPASS复合物酶学亚基Set1的缺失，导致了所有3个层次的甲基化修饰的完全丧失(图 4B)。以上研究表明，裂殖酵母Ash2主要参与调控了H3K4二、三甲基化修饰。

图2 5种真核生物Ash2同源蛋白多序列比对A：裂殖酵母Ash2蛋白的PHD和SPRY结构域；B：酿酒酵母、裂殖酵母、果蝇、小鼠及人中Ash2同源蛋白的序列比对。黑框表示物种间保守的结构域。

图3 裂殖酵母ash2+缺失突变体的PCR鉴定1：up5'/dw3'引物对鉴定(up5'位于 ash2+上游 100 bp，dw3'位于ash2+下游100 bp处，潮霉素中断盒筛选标记为1600 bp，PCR扩增获得与预期一致的1800 bp片段)；2：up5'/CR引物对鉴定(CR为潮霉素中断盒筛选标记内部反向引物，PCR扩增获得与预期一致的510 bp片段)；3：CF/dw3'引物对鉴定(CF为潮霉素中断盒筛选标记内部正向引物，PCR扩增获得与预期一致的620 bp片段)。

2.4 ash2+缺失导致产孢的延迟和产孢率下降

在氮源缺乏的条件下，裂殖酵母从有丝分裂过程转入减数分裂过程，最终产生孢子来应对营养缺乏的生存环境。为了检测Ash2是否参与裂殖酵母产孢过程，本研究计算了野生型细胞 h90和 h90ash2Δ突变体在缺乏氮源的固体培养基上的产孢效率。如图5A所示，野生型h90细胞的产孢效率为89.1%。ash2+缺失后，产孢效率下降为56.6%，相比于野生型h90降低了 36%。比较了 h90ash2Δ和野生型 h90在缺乏氮源的液体培养基中的产孢曲线，结果显示，相比于野生型 h90，h90ash2Δ细胞的产孢过程发生延迟，最终的产孢率也明显降低(图5B)。以上结果说明，Ash2参与了裂殖酵母产孢过程。

2.5 Ash2参与调控spk1+编码区的H3K4甲基化水

平和spk1+的转录水平

图4 Ash2定位在细胞核内并参与H3K4甲基化修饰A：Ash2在细胞中的定位(标尺=10 μm)；B：Western blot检测野生型wt、ash2Δ及set1Δ细胞中H3K4的甲基化水平。

为了验证Ash2是否通过影响H3K4甲基化参与产孢途径，本文比较了野生型h90和h90ash2Δ细胞中MAPK途径及其下游多个关键基因的编码区H3K4me2水平和转录水平。这些基因包括spk1+(编码MAPK)、ste11+(编码受到Spk1调控的转录因子)以及Ste11的靶基因mam2+、map3+和mei2+[21]。ChIP结果显示，在氮源缺乏的条件下，相对于野生型h90细胞，h90ash2Δ细胞中的 spk1+编码区的 H3K4me2水平显著下调(图6A)。与此相一致的是，定量PCR结果显示，h90ash2Δ细胞中spk1+的mRNA水平明显下调(图6B)。与spk1+的情况不同，h90ash2Δ细胞中的 ste11+以及 Ste11的靶基因 mei2+、mam2+和map3+编码区域的H3K4me2水平没有明显改变(图6A)，但Ste11的靶基因mei2+、mam2+和map3+转录水平发生了明显下降(图6B)，这提示Ash2可能通过调控spk1+编码区的H3K4me2水平，参与spk1+的转录激活，从而影响下游多个与产孢相关基因的表达。

3 讨 论

MAPK途径是真核生物应答外界信号刺激的的重要途径，外界的刺激信号包括生长因子、激素、细胞因子和压力。MAPK途径参与调控了细胞的生长、分化、凋亡、神经元功能和免疫反应等重要的生物学过程[22]，该途径的失调影响免疫系统和大脑功能从而引起肿瘤和癌症的发生[23,24]。因此对MAPK途径的调节机制的研究具有重要的临床价值。

图6 ash2+缺失对于MAPK途径及其下游关键基因的编码区H3K4me2和转录水平的影响A：ash2+缺失对于MAPK途径及其下游关键基因编码区的H3K4me2水平的影响。Y轴代表了相对于fbp1+编码区的富集度；野生型h90的数值设定为1，h90ash2Δ的数值为3次生物学重复的平均值，并给出了标准差。B：定量PCR分析ash2+缺失对于MAPK途径及其下游关键基因转录水平的影响。Y轴代表了相对于act1+的水平；野生型h90的数值设定为1，h90ash2Δ的数值为3次生物学重复的平均值，并给出了标准差。

本研究以COMPASS复合物亚基Ash2作为研究对象，发现Ash2参与了组蛋白H3K4的甲基化修饰。当ash2+缺失时，H3K4二甲基化水平下降，但并没有完全丧失，提示Ash2在二甲基化修饰中发挥了辅助的作用。ash2Δ细胞中，H3K4三甲基化修饰几乎完全丧失，说明Ash2在H3K4三甲基化修饰中发挥了关键的作用。本研究发现Ash2的缺失会导致产孢过程的延迟，推测Ash2可能参与了产孢过程的早期途径。信息素介导的MAPK信号通路是产孢早期的关键途径，它促进了细胞接合，起始减数分裂。MAPK信号途径的缺陷会中断产孢过程，导致产孢效率的急剧下降[25]。本研究检测了ash2+缺失时MAPK信号通路关键因子spk1+及下游和ste11+靶基因mei2+、mam2+和 map3+基因编码区 H3K4二甲基化修饰程度，发现Ash2通过影响spk1+编码区的H3K4二甲基化水平，参与调控 spk1+的转录。与 spk1+的情况不同，ste11+编码区的H3K4二甲基化水平和ste11+的转录水平并没有受到ash2+缺失的影响。本文推测，在ash2Δ细胞中，由于spk1+转录水平的降低，引起Spk1的蛋白水平下降，从而影响了Ste11的正常磷酸化。Ste11磷酸化的不足会引起其活性下降，从而导致了Ste11靶基因，如mei2+、mam2+和map3+的转录水平的降低。本研究结果表明Ash2对于spk1+编码区域的H3K4me2的调控具有特异性，提示可能存在特定的因子将Ash2征集到spk1+的基因座位。在哺乳动物中，转录因子 MEF2D被磷酸化后，招募 Ash2定位于肌肉细胞分化相关基因的启动子区域，提高了该区域的 H3K4甲基化水平，从而促进了相关基因的表达[26]。在裂殖酵母中，是否采用了相同的形式，由特异性的转录因子负责对Ash2的征集，还需要更多的后续研究进行验证。

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(责任编委: 何 群)

Ash2, a subunit of histone H3K4 methyltransferase complex, is involved in the sporulation in Schizosaccharomyces pombe

Wenchao Wang1,2, Huan Zhou1,2, Yao Yu1,2, Hong Lv1,2

1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Shanghai 200433, China
2. Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms Fudan University, Shanghai 200433, China

Schizosaccharomyces pombe undergoes meiosis instead of mitosis under conditions of nitrogen starvation and pheromone signalling, which results in conjugation and sporulation. During this progress, the pheromone-responsive MAPK(Mitogen-activated protein kinases) pathway plays an important role in regulating the conjuation and the transcriptionalactivation of genes required for meiosis. Spk1, a key component of MAPK pathway, activates Ste11 through protein phosphorylation and then induced the transcriptions of several genes requied for meiosis, including mei2+, mam2+and map3+. Methylation of histone H3K4 is involved in several important biological processes, including transcriptional activation and chromatin remodeling. However, its role in the sporualtion of fission yeast is poorly understood. Ash2 is a subunit of COMPASS, a conserved H3K4 methyltransferase complex. Sequence alignment analysis revealed that Ash2 in pombe shares two conserved domain with other homologues. Ash2 is localized in nucleus and contributes to methylation of H3K4. Deletion of ash2+resulted in a delay of sporulation and a substantial drop of sporulation efficiency. ChIP and qPCR analysis showed that deletion of ash2+caused a reduction of H3K4me2 level in the coding region of spk1+, as well as a reduction of its mRNA level. Although the mRNA level of ste11+kept unchanged, the levels of Ste11-targetted genes, such as mei2+, mam2+and map3+, all reduced in ash2Δ cells. The results suggest that Ash2 regulates MAPK pathway and sporulation through H3K4 methylation. This might provide a new clue to elucidate the link between meiosis and epigenetic regulation.

Schizosaccharomyces pombe; H3K4 methylation; Ash2; sporulation;MAPK

2014-04-01;

2014-04-15

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2009CB825601)，国家自然科学基金项目(编号：31200961)，高等学校博士学科点专项科研基金项目(编号：20120071120010)和上海市科委基地建设项目(编号：13DZ2252000)资助

王文超，硕士研究生，专业方向：微生物分子遗传学。E-mail：11210700068@fudan.edu.cn

吕红，博士，教授，研究方向：微生物遗传学。E-mail：honglv@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0943

时间: 2014-7-18 11:32:12

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140718.1132.002.html