CNR1、GAD1和BDNF基因多态性与云南傣族男性海洛因依赖的相关性分析

杨亚鲜，陈燕祥，武健权，邢豫明，曾发明，黄友浩，程宝文

1. 昆明医科大学法医学院，昆明 650500；

2. 云南省公安厅刑事科学技术研究所，公安部毒品分析及禁毒技术重点实验室，昆明 650283；

3. 西双版纳州公安局，西双版纳 666100

CNR1、GAD1和BDNF基因多态性与云南傣族男性海洛因依赖的相关性分析

杨亚鲜1,2，陈燕祥1,2，武健权1,2，邢豫明1,2，曾发明1,2，黄友浩3，程宝文1,2

1. 昆明医科大学法医学院，昆明 650500；

2. 云南省公安厅刑事科学技术研究所，公安部毒品分析及禁毒技术重点实验室，昆明 650283；

3. 西双版纳州公安局，西双版纳 666100

为了探讨大麻素受体 1基因(Cannabinoid receptor 1，CNR1)3个 SNP位点(rs6454674、rs1049353和rs806368)、谷氨酸脱羧酶 1基因(Glutamate decarboxylase 1，GAD1)3个 SNP位点(rs1978340、rs3791878和rs11542313)、脑源性神经营养因子基因(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)2个 SNP位点(rs6265和rs13306221)与云南傣族男性海洛因依赖的相关性，文章采用病例对照关联分析，建立8-SNPs复合扩增体系，应用SNaPshot方法检测165例傣族男性海洛因依赖患者和170例健康傣族男性CNR1、GAD1和BDNF基因8个SNPs位点基因型，采用 SPSS17.0、Haploview4.2、PHASE2.1和MDR软件进行统计学分析。结果显示，rs13306221基因型频率在海洛因依赖组和对照组中的差异具有统计学意义(P＜0.025)，海洛因依赖组rs6265 A等位基因显著高于对照组(P＜0.05)，由rs1978340-rs3791878-rs11542313构建的T-A-C、C-C-C、C-C-T和T-C-C单体型及rs6265-rs13306221构建的A-G单体型频率在海洛因依赖组及对照组中差异具有统计学意义(P＜0.05)，海洛因依赖组T-A-C、C-C-T和A-G单体型频率明显高于对照组，GAD1基因rs1978340与rs3791878之间可能存在强协同的交互作用。结果表明，CNR1基因rs1049353多态性、GAD1基因rs1978340和rs11542313多态性以及BDNF基因rs6265和rs13306221多态性与云南傣族男性海洛因依赖相关联，并且携带rs6265 A等位基因的个体可能更容易对海洛因产生依赖。

CNR1；GAD1；BDNF；海洛因依赖

毒品依赖指吸毒者对毒品易产生依赖行为，最主要特征是渴求用药，具有特征性的戒断综合征、复发性、耐受性和敏感性。据国家禁毒委公布的《2013年中国禁毒报告》显示：截至2012年底，全国累计登记吸毒人员209.8万名；滥用阿片类毒品人员127.2万名，其中海洛因吸毒人员124.5万名，占59.3%；滥用合成毒品人员79.8万名，其中甲基苯丙胺吸毒人员60.2万，占28.7%；全国缴获海洛因共7.3吨，海洛因仍为我国主要滥用毒品之一，这给社会带来巨大的经济损失。海洛因依赖是一种不顾后果的强制性寻觅和使用海洛因的行为。海洛因依赖受社会环境因素及遗传因素等影响[1,2]，家系调查结果及双生子、寄养子研究也都表明遗传因素在海洛因依赖中扮演着重要角色[3,4]。尽管其成瘾机制尚不十分明确，但中脑边缘奖赏系统被普遍认为在海洛因成瘾相关问题中发挥着重要的作用。包括海洛因在内的几乎所有的成瘾物质都对该系统有一定的作用[5]，或直接影响系统中多巴胺的功能，或通过其他神经递质如 γ-氨基丁酸、5-羟色胺能或胆碱能神经递质起作用[6]。药物依赖的神经生化机制都离不开多巴胺(Dopamine, DA)等单胺类神经递质系统，因而与上述递质系统有关的受体及代谢酶基因成为近年的研究热点，也成为研究海洛因依赖易感性的重要候选基因。大麻素受体 1(Cannabinoid receptor1, CNR1)主要分布于前额叶皮质 、杏仁核、伏隔核、纹状体和海马区，可以调节多种神经递质(如多巴胺、γ-氨基丁酸)的释放。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)是催化谷氨酸脱羧为 γ-氨基丁酸的限速酶，目前已经发现GAD1与GAD2两个亚型。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotophic factor, BDNF)是体内含量最多的神经营养因子，对 5-羟色胺和多巴胺能神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用。国内外学者对上述受体、酶基因进行了大量研究，发现与海洛因等物质依赖有关，但基因间是否存在交互作用未见报道。因此，本研究在云南傣族群体中选择CNR1基因3个SNP位点(rs6454674、rs1049353和rs806368)、GAD1基因3个 SNP位点(rs1978340、rs3791878和 rs11542313)和BDNF基因2个SNP位点(rs6265和rs13306221)，采用病例对照研究方法对上述基因与海洛因依赖的关联性及基因间交互作用进行了探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象

患者组：165例海洛因依赖者均来自于云南省西双版纳州劳教所的强制戒毒人员。纳入标准：傣族，男性，年龄20～50周岁，符合美国精神障碍诊断与统计手册第 4版(DSM-Ⅳ) 阿片依赖的诊断标准，以海洛因使用为主，无酒精或尼古丁等成瘾物质滥用史，排除精神疾病、遗传性疾病，相互间无亲缘关系。对照组：170例健康对照者来源于云南省DNA数据库。纳入标准：傣族，男性，年龄20～50周岁，无海洛因等非法成瘾物质使用史，无精神疾病史，相互间无亲缘关系。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物设计

采用 Investigator试剂盒(QIAamo公司，德国)提取全血基因组DNA。根据NCBI数据库查询的各位点信息，运用在线引物设计软件Primer3.0设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列信息见表1。

1.2.2 复合扩增体系建立

采用Touchdown PCR 程序，在9700(ABI，美国)扩增仪上进行扩增。扩增体系为 20 µL，含10×FastStart Taq Buffer(MgCl2)2 µL、25 mmol/L dNTP 1.6 µL、10 μmol/L PCR引物混合液8 µL、FastStart Taq DNA 聚合酶0.4 µL、模板2 µL。PCR扩增程序：95℃预变性10 min；95℃ 30 s，63℃ 50 s(每个循环降低0.5℃)，72℃ 1 min进行15个循环；然后95℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min进行25个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物纯化体系为6 µL，包括1 U/µL虾碱性磷酸酶(Phosphatase alkaline shrimp，SAP，Roche)1.5 µL、10 U/µL核酸外切酶(ExonucleaseⅠ，Exo-Ⅰ，Roche)0.15 µL、PCR产物2 µL。37℃ 60 min，85℃ 15 min进行纯化。

1.2.3 SNaPshot反应

采用 SNaPshot Multiplex 试剂盒(ABI，美国)，反应体系为8 µL，含Reaction Mix 0.3 µL，10 µmol/L延伸引物混合物6 µL，多重PCR纯化产物1 µL。扩增程序：96℃预变性1 min；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，共25个循环。结束后加入1 U/µL SAP 0.5 µL，37℃ 60 min、85℃ 15 min进行纯化。

1.2.4 检测及基因分型

以GeneScan-120Liz Size Standard(ABI)为内标，取1 µL产物与10 µL含有Liz的HiDi混合，95℃变性10 min，立即冰浴冷却3 min，然后采用ABI 3100型自动遗传分析仪进行电泳，应用 Genemapper ID v3.2软件进行数据分析和基因分型。

表1 8个SNPs位点及其引物序列

1.3 统计分析

应用SPSS17.0软件，对海洛因依赖组及对照组8个SNPs位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，验证样本的代表性，并对单位点基因型及等位基因频率进行非线性logistic回归分析，P值通过Bonferroni进行校正。运用HaploView 4.2软件对各位点间进行连锁不平衡分析。应用PHASE2.1软件构建单体型，进行单体型分析，并用SPSS17.0海洛因依赖组及对照组各单体型频率分布进行四格表卡方检验。运用多因子降维(MDR)软件对8个SNPs位点间进行交互作用分析，检验样本的准确度(Testing balanced accuracy, TBA)和交叉验证一致性(Cross-validation consistency, CVC )，设符号检验P＜0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 基因分型结果

本研究对CNR1基因3个SNPs位点(rs6454674、rs1049353和rs806368)、GAD1基因3个SNPs位点(rs1978340、rs3791878和rs1152313)和BDNF基因2个SNPs位点(rs6265和rs13306221)进行检测，均得到良好的分型结果(图1)。在8个SNPs位点基因型检测中，在rs13306221位点仅检测到2种基因型(GG和AG)，其余7个SNPs位点均检测到3种基因型，其中rs6454674位点检测到TT、TG和GG基因型，rs1049353和rs6265位点检测到GG、GA和AA基因型，rs806368、rs1978340和rs11542313位点检测到TT、TC和CC基因型，rs3791878位点检测到CC、CA和AA基因型。

图1 8个SNPs位点多态性图谱图中蓝色、黑色、红色和绿色峰分别代表G、C、T和A等位基因。

2.2 单位点分析

病例及对照组各位点基因型频率分布符合H-W平衡。海洛因依赖组及对照组基因型及等位基因频率分布logisic回归分析结果见表2。经过Bonferroni校正后，发现8个SNPs多态性位点中，仅rs13306221基因型频率分布在海洛因依赖组与对照组差异具有统计学意义(P＜0.025)。rs1049353、rs1978340、rs11542313、rs6265和 rs13306221等位基因频率分布在海洛因依赖组与对照组差异具有统计学意义(P＜0.05)，且经 Bonferroni校正后显示差异显著，海洛因依赖组rs6265多态性位点A等位基因显著高于对照组(P＜0.025)。rs6454674、rs806368和rs3791878 3个SNPs位点基因型及等位基因频率分布在海洛因依赖组与对照组分布无统计学差异。

2.3 多位点分析

应用 HaploView 4.2 软件对本研究中的 SNPs位点进行连锁不平衡分析(图2：A，B)，结果显示：在云南傣族男性中，海洛因依赖组与对照组各位点之间存在连锁不平衡现象，连锁程度较弱(D’＜0.8)。

应用PHASE2.1软件对CNR1、GAD1和BDNF基因8个SNPs位点构建单体型，并对海洛因依赖组及对照组各单体型频率进行四格表卡方检验(表 3)，频率低于 3%的单体型不进行分析。结果发现，由rs1978340-rs3791878-rs11542313构建的T-A-C、C-C-C、C-C-T和T-C-C单体型及rs6265-rs13306221构建的A-G单体型频率分布在海洛因依赖组及对照组中差异具有统计学意义(P＜0.05)，海洛因依赖组T-A-C、C-C-T和A-G单体型频率明显高于对照组。

表2 8个SNPs位点基因型及等位基因频率分布

图2 海洛因依赖组与对照组8个SNPs连锁图(D’)A：海洛因依赖组；B：对照组。

表3 CNR1、GAD1和BDNF基因单体型频率分布及卡方检验分析结果

表4 MDR分析基因-基因交互作用模型

2.4 MDR分析

对CNR1、GAD1和BDNF基因8个SNPs位点进行MDR分析，结果见表4。GAD1基因rs1978340与 rs3791878多态性位点的二因子模型检验准确度最大(TBA = 0.6551)，交叉验证一致性(CVC)为10/10，TBA与CVC值越大说明模型越好，因此rs1978340与rs3791878二因子模型为最佳模型，且符号检验P = 0.0010，具有显著性差异，提示这两个位点的交互作用与云南傣族男性海洛因依赖可能相关联。

图3 最佳图形模型该图形模型表示经MDR分析后，患者组和对照组分别在X6，X7(X6为rs1978340，X7为rs3791878)的各基因型组合中分布的例数(患者组例数以左侧条带表示，对照组例数以右侧条带表示)。深灰色小块表示该基因型组合中患者组例数/对照组例数超过比值阈(比值阈=全部病例组例数/全部对照组列数) ，提示高风险；浅灰色小块表示该基因型组合中患者组例数/对照组例数低于比值域，提示低风险。

图3为rs1978340与rs3791878二因子模型最佳模型的图形模型，从深灰色小块中可以看出携带X6(rs1978340)等位基因 C 的个体或携带X7(rs3791878)等位基因C的个体患海洛因依赖风险相对高，而当个体的rs1978340基因型为纯合子CC且 rs3791878基因型为杂合子 AC时，或个体的rs1978340基因型为杂合子CT且rs3791878基因型为纯合子CC时，患海洛因依赖风险相对较小。

图 4为各多态性位点交互作用的系统树，显示GAD1基Z因rs1978340(X6)与rs3791878(X7)多态性位点之间可能存在强协同的交互作用，其他位点间协调与消减作用不明显。

图4 各多态性位点交互作用的系统树该图以颜色谱表示自协同至消减的交互作用，最上端表示强协同，最下端表示强消减，中间颜色分别表示不同程度的协同或消减。图中 X4、X8、X1、X6和 X7分别代表 rs6265、rs11542313、rs6454674、rs1978340和rs3791878 SNP位点。

3 讨 论

当前，毒品泛滥问题严重影响社会的稳定和进步，对社会治安、经济发展、疾病控制、社会保障等诸多方面都有很强的负面作用，特别是海洛因等硬性毒品仍是严重威胁人类健康的元凶和公敌。因此，对毒品成瘾与戒断机理的研究及治疗也一直是研究者关注的热点。

大麻素受体系统与药物依赖及其他精神疾病中起重要作用[7]。Leroy等[8]对法国高加索人群研究发现 CNR1基因与药物依赖相关。随后 Zhang等[9]对欧裔、非裔美国人的研究也证实 CNR1基因与阿片类、可卡因和酒精滥用存在相关性。Li等[10]研究发现CNR1基因(AAT)n多态性与中国汉族海洛因依赖无关联性。最近Proudnikov等[11]通过对共计247例高加索人、161例西班牙人及 179例非裔美国人海洛因依赖情况与CNR1基因6个SNPs位点关联分析发现，仅在高加索人群中发现rs806379、rs1049353和rs59088366多态性位点的基因型频率分布与海洛因依赖显著关联，rs1049353位点GG基因型更容易对海洛因产生依赖(P=0.034)。本研究对云南傣族人群与CNR1基因rs6454674、rs1049353和rs806368多态性关联研究仅发现 rs1049353多态性位点与海洛因依赖相关联，海洛因依赖组rs1049353 A等位基因频率显著低于对照组。Marcos等[12]、Clarke等[13]及 Zuo[14]等在男性酒精依赖者与美国非洲裔可卡因依赖个体中研究证实 CNR1(rs6454674、rs1049353和rs806368)基因与酒精依赖及可卡因依赖存在明显相关性，但Clarke等[13]与Zuo等[14]的数据结合后分析，仅发现rs6454674位点与可卡因依赖存在关联性，这说明种族、群体分层及样本量差异可能导致研究结果不同。但这些研究都表明 CNR1基因在药物依赖(阿片类、可卡因、酒精)中发挥一定作用。

研究证实GAD1基因多态性可能与药物依赖相关。Kuo等[15]及 Terranova等[16]分别在爱尔兰人群及意大利人群酒精依赖情况与GAD1基因关联分析发现，GAD1基因与酒精依赖存在相关性。Levran等[17]对202例美国海洛因依赖者130个基因的1350个突变点研究发现，GAD1基因rs2058725位点与海洛因依赖存在显著关联性。Wu等[18]对中国汉族370例海洛因依赖者和389例对照样本GAD1基因的15个 SNPs多态性关联性研究发现，启动子区rs1978340、rs3791878 和外显子3 rs11542313 多态性等位基因或基因型频率与海洛因依赖有显著性差异。而本次在云南傣族人群中研究也发现rs1978340与rs11542313两个多态性位点等位基因频率与海洛因依赖相关联，海洛因依赖组rs1978340、rs11542313位点 T等位基因频率显著低于对照组(P=0.00585，P=0.0159)。通过国内外研究推测GAD1基因可能是海洛因依赖的一个候选基因。

在对BDNF基因和药物依赖关联性的研究中，关于功能多态性rs6265位点的研究结果报道并不一致。Haerian[19]对BDNF基因与药物依赖的研究进行了系统回顾及 Meta分析，发现 rs6265位点是南亚人群或中国人群海洛因依赖及甲基苯丙胺依赖者的危险因素。Meng等[20]对中国汉族486例海洛因依赖者与BDNF基因3个SNPs位点的研究发现，rs6265位点AA基因型携带者首吸年龄更早。Jia等[21]研究了 487例汉族海洛因依赖者与 BDNF基因的 4个SNPs位点海洛因依赖的关联性，发现 rs6265与rs13306221多态性位点与海洛因依赖存在显著的关联情况，且海洛因依赖组G等位基因频率明显高于对照组(P=0.001，P=0.005)，提示 G等位基因可能会增加海洛因依赖的易感性。而本研究在云南傣族人群中却发现rs6265多态性位点海洛因依赖组G等位基因频率低于对照组(P=0.0219)，G等位基因可能是一个保护因素。此外，有研究还证实rs6265多态性位点与精神分裂症、抑郁症等脑病相关，在神经元的存活、分化及突触可塑性调节、大脑学习记忆的过程中起重要作用。

综上所述，BDFN基因rs6265与海洛因依赖相关联，携带有A等位基因的个体可能更容易对海洛因产生依赖。本研究与前人研究结果基本一致，但也存在不一致情况。究其原因可能是：海洛因依赖是一个生理-心理-社会及遗传因素综合作用所形成的慢性复杂性脑病，遗传因素外其他因素也起一定作用；可能与种族差异、民族及地域差异、样本量小等因素有关；单个位点、单个基因的研究可能不能得出准确结论。因此，还需要进一步扩大样本量，通过对多个种群、多个基因和多个位点的研究，以了解海洛因依赖的遗传机制，从而对海洛因依赖做出基因诊断，为戒毒宣传及后续的基因治疗提供理论依据。

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(责任编委: 赖江华)

Association study of CNR1, GAD1 and BDNF polymorphisms with male heroin dependence in the Dai population in Yunnan

Yaxian Yang1,2, Yanxiang Chen1,2, Jianquan Wu1,2, Yuming Xing1,2, Faming Zeng1,2, Youhao Huang3, Baowen Cheng1,2

1. Forensic Medicine Department of Forensic Science College of Kunming Medical University, Kunming 650500, China;

2. Key Laboratory of Ministry of Public Security of Drug Analysis and Drug Control Technology, Public Security Department of Yunnan Province, Kunming 650283, China;
3. Xishuangbanna Municipal Public Security Bureau, Xishuangbanna 666100, China

Abstract:In order to analyze the association of CNR1(Cannabinoid receptor 1), GAD1(Glutamate decarboxylase 1), and BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) polymorphisms with male heroin dependence in the Dai population in Yunnan Province, an eight-SNP co-amplification protocol was established to genotype on the SNaPshot platform. A case-control study was performed with 8 SNPs from CNR1, GAD1, and BDNF genes in 165 heroin-dependent males and 170 healthy males of the Dai population. Statistical analyses were conducted with SPSS17.0, Haploview4.2, PHASE2.1, and MDR software. We found that: (1) the genotype frequency of rs13306221 was significant in the case group (P＜0.025); (2) the A allelic frequency of rs6265 was significantly higher in the case group; (3) the haplotypes of T-A-C, C-C-C, C-C-T, and T-C-C based on rs1978340-rs3791878-rs11542313 and haplotype A-G based on rs6265-rs13306221 were significant (P＜0.05); (4) the haplotype frequencies of T-A-C, C-C-T, and A-G were significantly higher in the case group. These results indicate that the linkage between rs1978340 and rs3791878 in GAD1 has a strong association with heroin dependence. Furthermore, polymorphisms in CNR1 (rs1049353), GAD1 (rs1978340 and rs11542313), and BDNF (rs6265 and rs13306221) were associated with heroin dependence in the Yunnan Dai population, and individuals with the rs6265 A allele were more likely to be heroin dependent.

CNR1; GAD1; BDNF; heroin dependence

2013-12-23;

2014-06-13

公安部科技强警基础工作专项项目(编号：2013GABJC017)资助

杨亚鲜，硕士研究生，专业方向：法医物证学。E-mail:1329113301@qq.com

程宝文，博士，主任法医师，研究方向：法医物证学。E-mail:ggcbw@vip.sina.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0888

时间: 2014-7-31 9:24:06

URL: http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3724/SP.J.1005.2014.0000.html