北京油鸡MSAP毛细管电泳荧光检测技术的建立

李金龙, 唐韶青, 邹智元, 王海潮, 徐青

1. 北京交通大学生命科学与生物工程研究院, 北京 100044;

2. 北京市畜牧总站, 北京 100029;

3. 北京交通大学软件学院, 北京 100044

北京油鸡MSAP毛细管电泳荧光检测技术的建立

李金龙1, 唐韶青2, 邹智元3, 王海潮1, 徐青1

1. 北京交通大学生命科学与生物工程研究院, 北京 100044;

2. 北京市畜牧总站, 北京 100029;

3. 北京交通大学软件学院, 北京 100044

采用毛细管电泳荧光检测技术, 对北京油鸡肌肉组织基因组进行甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)检测。通过对基因组DNA用量、预扩产物稀释倍数、选择性引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和电泳内标量等6个主要参数进行分析和优化, 建立了适合北京油鸡基因组DNA甲基化分析的MSAP毛细管电泳荧光检测技术。重复实验表明, 建立的毛细管电泳荧光标记的MSAP检测技术能够自动地、高通量地分析北京油鸡基因组的DNA甲基化状态, 也适用于其他动植物基因组的DNA甲基化研究。

MSAP; 毛细管电泳; 荧光标记; 北京油鸡

DNA甲基化是指 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基团在 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)作用下共价结合到胞嘧啶5'碳原子上的过程[1]。在真核生物中, DNA甲基化主要在基因组CCGG位点以 5-甲基胞嘧啶的形式存在[2], 这些甲基化修饰大部分发生在编码区和非编码区的重复序列中,如内含子和转座子等[3], DNA甲基化在基因的表达调控、细胞分化和疾病的发生等方面起着重要的作用[4,5]。

在全基因组水平上对 DNA甲基化进行检测的处理原则包括亚硫酸氢盐处理和酶切处理等[6], 其中以酶切和PCR技术为基础的MSAP方法敏感性强,操作简单, 适用于没有任何信息的全基因组范围CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平的分析。MSAP是由扩增片段长度多态性(AFLP)经过改进而来, MSAP利用一组对基因组CCGG位点甲基化敏感性不同的同裂酶 HpaⅡ和 MspⅠ对基因组进行酶切、PCR扩增以及电泳之后产生的差异图谱来分析样品的甲基化模式和程度。目前, MSAP方法已经广泛应用在动植物甲基化相关的研究中[7,8]。

毛细管电泳结合荧光标记进行片段分析技术的发展适应于高通量、大规模检测数据的要求, 能够实现片段分析的自动化, 减少手工分析的错误, 是一种快速、准确、高效率地分析PCR扩增产物的方法。目前, 毛细管电泳结合荧光标记在分子标记SSR、AFLP以及动物遗传疾病等全自动分析中取得了较大的进展。吕金辉等[9]基于毛细管电泳技术建立了适合柳树的AFLP分析方法。王凤格等[10]采用毛细管电泳荧光检测技术通过ABI 3730 xl DNA分析仪进行了玉米SSR标记的片段分析, 构建了玉米标准DNA指纹数据库。Justyna等[11]比较了不同因素对毛细管电泳结果的影响, 并应用改进的毛细管电泳技术, 对黑麦草进行 AFLP分析。初芹等[12]利用该技术建立了可同时检测牛蜘蛛腿综合征两个致病位点的方法, 为我国牛群中牛蜘蛛腿综合征致病位点的筛查工作奠定了基础。

与 AFLP等分子标记的检测相似, 传统的MSAP多采用常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法来再现扩增片段的甲基化状态, 实验程序比较复杂, 费时费力, 只适用于检测样品较少的情况。2005年, 本课题组在传统的MSAP方法基础上建立了基于PAGE电泳结合荧光标记的MSAP方法, 并应用于鸡的DNA甲基化研究[13]。MSAP方法的改进解决了传统银染分辨率低的问题, 但仍需手动上样, 且每次最多只可检测 24个样品的人工误差及低通量问题没有得到较大改善。2011年, 杨春等[14]应用结合测序胶及荧光标记的MSAP方法对猪不同组织及不同品种之间DNA甲基化的差异进行了检测。目前,毛细管电泳荧光标记的MSAP在国内外的研究中还没有相关的报道。本研究以北京油鸡为实验材料,通过对影响酶切、选择性扩增及毛细管电泳等反应体系中的重要参数进行了详尽的比较和分析, 建立了适合北京油鸡的 MSAP毛细管电泳荧光检测技术。

1 材料和方法

1.1 实验动物及基因组提取

选择17周龄纯种北京油鸡肌肉组织0.2 g, 应用组织基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取基因组 DNA, 结果于 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf公司)测定浓度。

1.2 甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

在 MSAP方法中, 使用两个同裂酶 HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP方法的MseⅠ酶, 通过对样品进行酶切、连接、扩增和电泳等实验步骤来完成样品的基因组甲基化检测。其中接头序列、预扩增引物序列和选择性引物序列参照徐青[15]方法, 分别取等量的E接头上下游引物混匀, 依照94℃ 1 min, 65℃ 1 min反应完成 E接头处理过程, H-M接头做同样处理。选择性扩增引物采用FAM荧光标记, 接头和引物的序列信息详见表1。

对于每份油鸡基因组 DNA, 同时设置 MspⅠ/EcoRⅠ和 HpaⅡ/EcoRⅠ两种酶切反应：基因组DNA 450 ng, EcoRⅠ和HpaⅡ各12 U, MspⅠ10 U, 37℃水浴酶切6 h, 65℃灭活15 min; 酶切产物2.5 μL, 按照DNA Ligation Kit (TaKaRa公司)要求, 16℃连接2.5 h, 65℃灭活15 min, 加水稀释10倍; 稀释后的产物2 μL, 按94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 72℃ 7 min过程进行30个循环预扩增反应。稀释后预扩增产物2 μL, H-M+3引物30 ng, E+3引物5 ng, dNTP Mixture 1.6 μL, MgCl21 μL,Ex Taq酶0.1 μL, 加水补至20 μL。PCR扩增条件：94℃ 5 min, 94℃ 30 s, 65℃(-0.7℃/循环) 30 s, 72℃1 min, 共 13个循环; 之后 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 进行23个循环, 最后72℃延伸7 min。限制性内切酶购自Promega公司, PCR扩增试剂购自TaKaRa公司。

表1 MSAP分析中使用的接头和引物序列

实验过程中 MspⅠ/EcoRⅠ和 HpaⅡ/EcoRⅠ两种酶切反应得到结果无较大差异, 且两种结果随各条件变化趋势一致, 因此本实验中提到的结果为HpaⅡ/EcoRⅠ酶切处理后的结果, MspⅠ/EcoRⅠ酶切结果作为验证结果使用。毛细管电泳荧光检测与数据分析方法如下：在96孔板的各孔中分别加入3 μL选择性扩增产物, 6.67 μL甲酰胺, 0.33 μL ROX 800分子量内标, 95℃变性5 min, 冰上放置10 min,瞬离1 min, 在ABI 3730 xl DNA分析仪上进行毛细管电泳。10 kV预电泳1 min, 3 kV进样15 s, 10 kV电泳 70 min。收集原始数据, 系统将各峰值的位置与其泳道中的 ROX 800分子量内标做比较, 通过GeneMapper 4.0软件对收集的原始数据进行分析。

1.3 实验设计

本实验首先对酶切反应中的基因组用量进行梯度筛选, 在常用的500 ng左右做4个梯度。在选择性扩增反应过程中, 分别对预扩产物稀释倍数、选择性引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度设置检测梯度, 在毛细管电泳过程中, 对内标用量进行比较,参数设置的详细信息及实验中获得的主要数据结果见表 2。根据荧光图谱中内标和样品峰密度、峰高度、杂峰错峰等情况评价MSAP和毛细管电泳过程最适反应条件。

2 结果与分析

2.1 MSAP分析中基因组DNA适宜用量的确定

在 MSAP-毛细管电泳荧光检测技术中, 基因组DNA的质量和数量对MSAP扩增片段的数量、荧光信号强度及片段峰型都具有较大的影响。基因组DNA用量过少或过多都会导致扩增片段减少, 而过多的基因组用量还可能影响酶切效率, 最终降低MSAP分析的准确度。本研究发现酶切模板量为150和300 ng时, 样品扩增条带整体峰值较高, 峰密度较均匀, 当模板量为450 ng时, 样品扩增片段的数量及峰值达到最佳状态(图 1A, 表 2), 而模板量为600 ng时, 样品扩增片段峰值较低, 异常峰型较多,扩增片段数相对较少(图1B, 表2)。因此, 本文认为模板量450 ng为较合适用量。

2.2 选择性扩增反应中预扩增产物稀释倍数的确定

预扩增产物进行稀释后用于选择性扩增反应,本研究比较了预扩增产物分别稀释5倍、10倍、20倍、50倍后的选择性扩增反应的结果, 发现当稀释倍数为5倍时, 500 bp左右的扩增片段数量较少(图2A, 表 2), 而当稀释倍数达到 20倍以上时, 100～250 bp之间的扩增片段数量较少(图2C, 表2), 并且峰值普遍较低。相比较而言, 稀释倍数为 10倍时,扩增条带分布均匀, 扩增峰值荧光信号较强, 为较适宜条件(图2B, 表2)。

2.3 选择性扩增反应中引物用量的确定

在选择性扩增反应中, 引物用量是决定扩增结果是否理想的重要因素之一。引物过量会导致样品的非特异性扩增, 反之则会使扩增片段数大量减少。当引物用量为实验设定的最低值时, 500 bp左右的片段扩增效率最高, 而100～245 bp的扩增效率最低(图3A)。随着引物用量的增加, 500 bp左右的扩增条带数逐渐减少, 而100～245 bp的片段数越来越多, 当浓度为实验设定的最大值时, 100～245 bp的片段超过了所有扩增片段总数的60%(图3C, 表3)。如图3B所示,在选择性扩增反应中, 引物终浓度为E(0.25 ng/μL)/ H-M(1.5 ng/μL)时, 产生的扩增条带大小分布均匀, 扩增峰值荧光信号强度适中, 为较理想的扩增条件。

表2 MSAP毛细管电泳荧光检测分析中各参数的设置及获得的MSAP扩增片段数

图1 不同基因组DNA用量的荧光图谱A：450 ng; B：600 ng。

2.4 选择性扩增反应中Mg2+浓度的确定

在选择性扩增反应中, 镁离子浓度可影响聚合酶活性及扩增片段特异性, 本文设置了 0.625 mmol/L、1 mmol/L、1.25 mmol/L、1.5 mmol/L等4个浓度梯度。电泳结果显示, 当选择性扩增反应体系中的Mg2+浓度为0.625 mmol/L时, 扩增条带的数量较少, 峰值较低, 随着 Mg2+浓度的增加, 扩增条带的数量和峰值均显著提高。但是, 当 Mg2+浓度为1.5 mmol/L时(图4B), 毛细管电泳荧光检测中的内标出现了较严重的乱峰现象。在本实验中, 1.25 mmol/L 的Mg2+浓度为较适的反应条件(图4A)。

2.5 选择性扩增反应中dNTPs浓度的确定

选择性扩增反应中, dNTPs浓度对扩增结果的影响是很明显的, 当dNTPs浓度为0.15 mmol/L时,样品峰和内标峰均能满足实验要求, 当dNTPs浓度增加到0.2 mmol/L时, 扩增条带开始减少, 尤其是大片段减少非常明显, 继续增加dNTPs浓度至0.25 mmol/L及以上时, 扩增条带数仅为图5A的50%左右(图5B, 表2), 所以, 当dNTPs浓度为0.15 mmol/L时, 大片段能有效扩增且整体扩增结果是最理想的,因此将实验中dNTPs浓度定为0.15 mmol/L。

表3 不同引物浓度获得的选择性扩增片段结果

2.6 毛细管电泳中内标用量的确定

在毛细管电泳中, 每个样品孔内均含有内标,内标使用量较大。标准的毛细管电泳内标的使用量为每孔5 μL, 本实验对内标使用量5 μL和2.5 μL进行了比较。实验结果显示, 内标量减半时的结果与正常内标量实验结果无显著差别(图 6, 表 2), 所以使用2.5 μL的内标量可以满足实验的要求。

3 讨 论

相对于传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测分析, 毛细管电泳荧光检测 MSAP技术省去了凝胶配制、手动上样及银染等繁琐步骤, 提高了检测效率, 较大地减少了手动操作中的人为误差, 增强了实验结果的稳定性和准确性, 而且可对96个样品进行同时检测, 满足了大量样品检测的高通量需要[16]。毛细管电泳荧光检测MSAP不但包括与传统的MSAP同样的酶切、连接、预扩增、选择性扩增等过程, 而且包括毛细管电泳荧光检测特有的内标使用、进样时间和荧光检测等过程, 每个过程每个小的反应参数都会对检测结果产生或大或小的影响。本实验以北京油鸡肌肉组织为材料, 通过对基因组DNA用量、PCR模板量、引物浓度等6个重要参数进行了不同设置值的比较, 并根据荧光图谱中内标和样品峰密度、峰高度、杂峰错峰等数据来确定了适合本研究的最适反应条件, 成功建立了毛细管电泳荧光检测 MSAP技术体系, 为北京油鸡的全基因组 DNA甲基化分析提供了完善的技术分析平台, 经多次实验论证, 本文所建立和优化后的体系具有较高的稳定性和可重复性。另外, 本研究也对不同DNA聚合酶对扩增结果的影响, 毛细管电泳相关的不同上样量及不同预电泳时间对结果的影响进行了比较, 在本文中, 没有发现这些参数对结果具有显著的影响, 或者可通过其他参数来控制这些条件, 所以本文没有显示这几个参数的比较结果,如需要相关的数据, 请联系本文的通讯作者。

图4 Mg2+浓度对选择性扩增结果的影响A：Mg2+浓度为1.25 mmol/L时样品峰及内标峰; B：Mg2+浓度为1.5 mmol/L时样品峰及内标峰。

图5 dNTPs浓度对选择性扩增结果的影响A：0.15 mmol/L; B：0.2 mmol/L。

图6 内标上样量对电泳结果的影响A：2.5 μL内标时样品峰及内标峰; B：5 μL内标时样品峰及内标峰。

在选择性扩增反应中引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、预扩增产物稀释倍数等参数对扩增结果都有影响。本实验发现引物浓度和dNTPs浓度是选择性扩增反应的关键因素, 尤其是引物浓度, 较低的引物浓度有利于较长片段的扩增, 这在其他研究也有相关报道[17]。随着引物浓度的增加, 样品长片段数量减少, 小片段数量逐渐增加。因此, 在应用MSAP方法进行基因组DNA甲基化分析时, 研究人员可根据自已的研究目地调整引物浓度获得自已感兴趣的扩增片段。而在毛细管电泳过程中, 每个孔道内均含有内标和样品, 在进样时, 样品、内标及杂质之间, 同一样品的不同片段之间均为竞争关系。本研究结果显示基因组 DNA的用量通过间接影响选择性扩增产物的扩增结果来影响荧光检测图谱的内标峰值、峰型和样品峰峰值。但对于相同的选择性扩增产物, 上样量越低, PCR扩增产物中的杂质含量也就趆少, 虽然样品峰值较低, 但由于缺少进样竞争内标峰值相对较高。另外, 相对于长片段来说, 小片段是优先进样的, 上样量过高会导致小片段区的峰值过高, 而过高的样品峰值会拉起内标峰,使内标峰在小片段区域产生杂峰, 影响结果的准确性。所以使用合适的基因组DNA量作为模板, 选择性扩增反应中对预扩增产物进行适当的稀释是保证选择性扩增产物最适宜上样量的两个重要条件。另外, 本研究发现在毛细管电泳中, 将标准内标使用量减半时, 结果未受到影响, 因些, 在实验过程中可以减少内标用量, 节省实验成本。

本文没有对酶切时间和PCR程序等进行比较和分析, 因为这些条件相对稳定[18], 对实验结果影响较小。虽然本文对影响毛细管电泳荧光检测 MSAP技术的多种因素进行了详细的分析和比较, 确定了适合北京油鸡基因组甲基化检测的条件。但在实验中, 因为检测的样品不同, 所用的仪器不同, 所用的试剂不同, 研究人员的实验习惯不同等因素都会影响实验的结果, 所以每位科研人员应根据自已的研究目地和研究条件, 参照本实验确定的适宜条件,进行预实验, 最后确定适合自已的参数值。表 4中是对毛细管电泳过程中的一些常见问题及解决方法进行的总结, 供大家参考。

表4 毛细管电泳过程中常见问题及解决方法

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(责任编委: 李辉)

Establishment of fluorescence labeling and capillary electrophoresis in MSAP for Beijing You chicken

Jinlong Li1, Shaoqing Tang2, Zhiyuan Zou3, Haichao Wang1, Qing Xu1

1. Institute of Life Science and Biotechnology, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China;
2. Beijing Animal Husbandry Station, Beijing 100029, China;
3. Institute of Software, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China

The DNA methylated states in muscle tissues from Beijing You chicken were analyzed using methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP) combined with fluorescence labeling and capillary electrophoresis technology. We optimized the MSAP experimental condition including the genomic DNA concentration, dilution of pre-amplification product, the internal standard content and the concentrations of selective primers, Mg2+and dNTPs. Repeated experiments showed that this method can automatically detect the global DNA methylation states in Beijing You chicken, and can be extended to other animals or plants with complex genomes and rich methylation polymorphism.

methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP); capillary electrophoresis; fluorescence labeling; Beijing You chicken

2013-09-29;

2013-12-09

国家自然科学基金青年基金项目(编号：31101711), 北京市自然科学基金项目(编号：6112018)和中央高校基本科研业务费专项基金项目(编号：2012JBZ003)资助

李金龙, 硕士研究生, 专业方向：分子遗传学。E-mail: lijinlong880827@163.com

徐青, 博士, 副教授, 研究方向：分子遗传学。E-mail: qingxu@bjtu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0495

时间: 2014-1-22 10:41:22

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140122.1041.001.html