依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡相关蛋白Bcl-2及Caspase-3表达的影响

潘 登谭 军

（1 新乡市第一人民医院神经内科，河南 新乡 453000；2. 新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003）

依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡相关蛋白Bcl-2及Caspase-3表达的影响

潘 登1谭 军2

（1 新乡市第一人民医院神经内科，河南 新乡 453000；2. 新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003）

目的 观察依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注后神经凋亡相关蛋白Bcl-2及Caspase-3表达的影响。方法 72只SD大鼠随机分为假手术组（S组）、缺血对照组（IR组）和依达拉奉治疗组（P组）（每组24只），利用大脑中动脉栓线阻断法制作大鼠局灶性脑缺血2 h后再灌注损伤模型，以免疫组化染色，依术后处死动物时间不同，在缺血再灌注后不同时间点2、24、72 h（每组8只）观察各组大鼠大脑神经元凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的不同。结果 在不同时间点依达拉奉治疗组大鼠Bcl-2阳性细胞表达的数目高于缺血对照组（P＜0.05），而Caspase-3阳性细胞表达数目则低于缺血对照组（P＜0.05）。结论 依达拉奉对大鼠缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，可能与增加Bcl-2的表达，减少Caspase-3的表达有关。

脑缺血再灌注；依达拉奉；细胞凋亡；Bcl-2；Caspase-3

溶栓是目前治疗急性缺血性卒中最有效的方法，但仅有少数患者获益，主要原因是溶栓时间窗狭窄，另外溶栓后出血转化率增高和再灌注损伤也是其不可忽视的不良反应[1]。因此长期以来一直在寻找有效保护措施来解决溶栓后的缺血再灌注损伤，而依达拉奉是一种自由基清除剂，抑制脂质过氧化，减少炎性介质从而有保护脑组织的作用[2]。本实验采用大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）致局灶性脑缺血模型，观察依达拉奉对大鼠脑缺血后梗死体积和神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达的影响，从分子水平上探讨依达拉奉对脑缺血再灌注后神经元损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及给药

选取雄性SD系大鼠72只，体质量150～250 g（购自新乡医学院实验动物中心），随机将大鼠分为假手术组、缺血再灌注组、依达拉奉治疗组，每组24只。假手术组（S组 n=24）手术仅暴露双侧CCA不结扎，30 min后缝合颈部切口，同时尾静脉给药，给予生理盐水0.5 mL/kg，每日2次；缺血再灌注组（IR组，n=24）：采用Longa线栓法制备大鼠MCAO模型[3]，缺血2 h后再灌注，同时尾静脉给药，给予生理盐水0.5 mL/kg，每日2次；依达拉奉治疗组（P组，n=24）：采用Longa线栓法制备大鼠MCAO模型[3]，缺血2 h后再灌注，同时尾静脉给药，给予依达拉奉1 mg/kg，每日2次，依达拉奉由南京先声药业有限公司提供。各组又随机分为缺血再灌注后2、24、72 h三个时间点亚组，每亚组动物8只（n=8），共9组。

1.2 动物模型的制作

参照Longa等[3]的大脑中动脉闭塞（MCAO）线栓法略做改进。以20%乌拉坦（5 mL/kg）腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠仰卧位固定，消毒皮肤，铺无菌洞巾，颈正中切口，钝性分离左侧颈总动脉（CCA）结扎同侧CCA近心端和颈外动脉（ECA）分叉处，距CCA末端约5 mm处剪口，将直径0.2 mm尼龙线沿颈内动脉（ICA）方向插入，所用栓线为直径0.2 mm尼龙渔线，头段烧圆，顶端直径约0.25～0.28 mm。术后缝合伤口，深度由分叉部计算约（18.5±0.5）mm，感觉有阻力即达大脑中脉起始部，完全阻断其血流，于ICA近心端结扎该动脉，全层缝合切口，再灌注时抽出尼龙线1 cm，于脑缺血手术2h后再灌注，即造成缺血再灌注模型。术中室温在（26±0.5） ℃，实验中保持大鼠体温（37 ±0.5） ℃，大鼠MCAO模型的神经功能评分采用Zea Lon-ga评分法，0分：无神经系统功能缺失症状，活动正常者；1分：不能完全伸展对侧前爪者；2分：出现左侧Horner征，爬行时出现向右转圈者；3分：行走时身体向右侧偏瘫侧倾倒者；4分：不能自发行走者，意识丧失者。评分为0分和4分者均被剔除，随机补充，保证每小组8只不变。

1.3 标本采取和组织切片制备

SD大鼠脑缺血再灌注后第2、24、72 h，大鼠深度麻醉后，开胸，从左心室先快速灌注37 ℃生理盐水100 mL，再灌注4%多聚甲醛100 mL，处死断头后迅速取脑，置于4%多聚甲醛液中固定4 h，然后放入30%蔗糖中，4 ℃冰箱过夜至组织块沉底。将组织块取出放入-20 ℃恒温冰冻切片机中从视交叉前缘向后做连续切片，片厚7 μm。取相同层面切片分别做HE染色和免疫组织化学染色。免疫组化采用SP法，DAB显色。所用抗Bcl-2；Caspase-3的浓度均为1∶400，由Santa Cruze公司提供；SP即用型工作试剂盒由北京中山生物公司提供。

1.4 统计学处理

应用SPSS16.0版软件进行单因素方差分析，均数间两两比较用q检验。

2 结 果

2.1 HE染色

假手术组各区脑组织染色均匀，组织结构致密清晰，神经细胞呈锥体状颗粒状及不规则形，细胞排练整齐，胞体较大，核仁明显。缺血再灌注组2 h病灶脑组织结构紊乱，HE染色不均，深浅不一，神经元细胞减少、皱缩、核染色浓缩；细胞间隙增宽，胞体变形，胞质呈嗜酸性，染色较淡。病灶中心区出现大量神经细胞坏死，周围出现较多正常细胞和可逆性受损细胞，伴少量炎性细胞浸润；再灌注后24 h对照组出现明显的神经细胞坏死，缺血中心区大量神经细胞坏死，范围较2 h增大，病灶周边区存在泡沫细胞，血管扩张及间质水肿，也有较明显的炎性细胞浸润。依达拉奉各治疗组与相应缺血再灌注组对比，坏死面积明显缩小，神经细胞相对受损较轻。依达拉奉治疗组对比缺血再灌注组有明显治疗效果。

2.2 Bcl-2免疫组织化学染色法使用SP法

Bcl-2阳性细胞为棕黄色细胞。每片选取10个有效视野，分别为纹状体区5个，大脑皮质5个，分别计数视野内的棕黄细胞数，取其平均值为有效计数。缺血再灌注后2 h在皮质和基底节区可观察到Bcl-2阳性细胞分布均匀，缺血再灌注后24 h棕黄色数量减少，缺血再灌注后72 h数量明显减少。对比治疗组与再灌注组，Bcl-2阳性细胞数在相对应的时间点表达明显增多，有统计学意义（表1）。

表1 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Bcl-2阳性细胞数比较（，n=8）

表1 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Bcl-2阳性细胞数比较（，n=8）

注：与假手术组对比P*＜0.05与缺血再灌注组对比P#＜0.05

分组 再灌注2 h 再灌注24 h 再灌注72 h假手术组 21±1 7±4 8±1缺血再灌注组 30±2* 21±2* 28±5*依达拉奉组 49±6# 38±7# 48±5#

2.3 Caspase-3免疫组织化学染色同上述的计数方法

缺血再灌注后2 h，在基底节和皮质区，可观察到仅有少量散在的Caspase-3阳性细胞存在，缺血再灌注后24 h在上述区域可观察到Caspase-3阳性细胞显著增多，缺血再灌注72 h后Caspase-3阳性细胞增加更多。在相对应时间点，对比依达拉奉治疗组与缺血再灌注组，Caspase-3阳性细胞数表达明显减少，有统计学意义。提示依达拉奉有抑制促凋亡蛋白Caspase-3的作用（表2）。

表2 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Caspase-3阳性细胞数比较（，n=8）

表2 缺血再灌注2 h，24 h，72 h Caspase-3阳性细胞数比较（，n=8）

注：与假手术组对比P*＜0.05与缺血再灌注组对比P#＜0.05

分组 再灌注组2 h 再灌注24 h 再灌注72 h假手术组 28±2 66±12 55±8缺血再灌注组 14±5* 48±6* 35±5*依达拉奉组 6±2# 27±4# 18±3#

3 讨 论

脑卒中是全球第二大最常见的死亡和致残原因，在中国已成为首位死因，其中缺血性脑卒中占全部脑卒中患者的60%～80%，如何有效治疗溶栓后缺血再灌注损伤是一个不容忽视的课题[4]。有研究表明缺血明再灌注后神经细胞死亡主要有坏死和凋亡两种形式，分别涉及主动和被动细胞死亡机制。缺血再灌注后神经细胞死亡是一个比较复杂的病理过程，在急性期，病灶中心区出现神经元皱缩、坏死，神经元坏死与凋亡并存，以坏死为主。坏死区周边的区域叫半暗带区，半暗带区神经元要经过1～2 d潜伏期才出现凋亡，提示细胞凋亡是缺血半暗带细胞死亡的主要方式，呈进行性死亡，最终凋亡可能决定了梗死体积[5]。自1988年以来，有关凋亡基因和蛋白的研究也越来深入，有大量的动物实验证实细胞凋亡存在于缺血性神经元损伤过程后。其中，有关Bcl-2家族蛋白的研究较多，Bcl-2家族作为细胞凋亡的调控因子，在神经细胞凋亡线粒体途径中起重要的调节功能[8]。在细胞内外的各种促发因子的作用下，引起细胞内Bcl-2家族表达的变化或蛋白质结构的改变，通过对线粒体外膜通透性的调控，引起膜间隙凋亡蛋白释放。形成蛋白性孔道，或引起线粒体膜势能的改变，通透性增加，促凋亡物质释放；甚至某些Bcl-2家族成员还可能调节线粒体膜的脂质组分及其对其他家族成员在线粒体膜上形成孔道的能力，调控凋亡。Bcl-2是重要的抑制神经细胞凋亡的蛋白，在脑缺血后2～4 h Bcl-2开始表达，随着缺血坏死的加重24 h后表达明显减少。Isenmann等研究发现，在局灶性缺血模型中Bcl-2在缺血半暗带区存活的神经细胞中表达明显。Caspase是一些半胱氨酸蛋白酶家族，是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，其参与了局灶性脑缺血后神经细胞损伤的病理过程，在细胞凋亡过程中，起着关键性的作用[6,9,10]。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，细胞色素C从线粒体内释放是关键的一步。细胞色素C在dATP存在条件下，与凋亡细胞酶激活因子Apaf-1结合，并激活Caspase9，就能次序的激活其下游的Caspase2、3、6、7、8、10，形成Caspase级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物，引起细胞凋亡。Caspase-3被认为是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路[7,9,10]。研究表明缺血后2～8 h有Caspase-3的表达，随着缺血坏死的加重其表达明显增加，24h时达高峰。本研究结果表明，在再灌注2、24、72 h依达拉奉治疗组对脑缺血有保护作用。依达拉奉治疗组与对照组在对应时间点相比，Bcl-2表达增多，Caspase-3表达减少，说明依达拉奉对脑细胞凋亡有抑制作用。HE染色也显示依达拉奉能明显保护缺血半暗带。本实验研究结果为临床缺血性脑卒中的治疗提供了实验室依据。

[1] Wang X,Tsuji K,Lee SR,et al.Mechanisms of hemorrhagic transfonna-lion after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for isohemic stroke[J].Stroke,2004,35(11 Suppl 1):2726-2730.

[2] Zhang P,Li W,Li L,et al.Treatment with edaravone attenuates ischemicbrain injury and adult rats after focal inhibits neurogenesis in the subventricular zoo of adult rats after focal cerebral ischemia and reperfusion injury[J].Neuroscience,2012,201;297-306.

[3] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible Middle Cerrbral Artery Occlusion without Craniectomy in R[J].Stroke(S0039-2499), 1989,20(1):84-91.

[4] 中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010[J].中国全科医学,2011,14(35):4013-4017.

[5] Love S.Apoptosis and brain ischaemia[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2003,27(2):267-282.

[6] 张文榜,刘义,董为.Caspase-3对缺血性脑损伤的影响[J].国外医学:脑血管病分册,2000,8(2):21.

[7] Cheng EH,Kiseh DC,Clem RJ,et al.Conversion of Bcl-2 to baxlike death factor by caspases[J].Science,1997,278(5345):1966-1968.

[8] 张臻年,李继英,赵扬,等.通脑活络针刺疗法对大鼠急性脑梗死Bcl-2及Caspase-3的影响[J].中国中西医结合杂志,2013,33(5): 646-648.

[9] 岳原亦,张扬,张一奇.Caspase家族与细胞凋亡[J].中国医药前沿, 2011,6(6):25-26.

[10] 富苏,范吉平.通络化痰胶囊对脑缺血损伤大鼠神经细胞凋亡及缺血半暗带cytc、caspase-9和Caspase-3表达的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(5):1194-1198.

Effects of Edaravone on Bcl-2 and Caspase-3 Expression Related to Neurons Apoptosis after Local Cerebral Ischemia Reperfusion

PAN Deng1, TAN Jun2
(1 Department of Neurology, Xinxiang First People’s Hospital, Xinxiang 453000, China; 2 Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective To investigate the effects of Edaravone on the expression of Bcl-2 and Caspase-3 of apoptosis of neurons after local cerebral ischemia reperfusion.Methods SD rats were randomly divided into shame operation group, control group and Edaravone group (n=24). The middle cerebal artery of rats was occluded for 2h by inserting an intraluminal filament, and reperfusion was then performed for 2, 24,72 h(n=4). The brains were embedded onto slides with paraffin for morphological assessment and immunhistochemistry was carried out to investigate the changes in Bcl-2 and Caspase-3. Results The expressions of Bcl-2 in all Edaravone groups at different times increased than each of the control groups and the expressions of cpspase-3 decreased in all Edaravone groups at different time than each of the control groups. Conclusion Edaravone is effective on cerebral ischemia reperfusion injury,the protective effect is perherps related to increase the expression of Bcl-2 and decrease the expression of Caspase-3.

Cerebral ischemia reperfusion; Edaravone; Apoptosis; Bcl-2; Caspase-3

R743

：B

：1671-8194（2014）05-0024-02