温阳振衰颗粒对阿霉素诱导慢性心衰兔心肌细胞外信号调节激酶5表达的影响

陈新宇，蔡虎志，史 微，陈青扬，卢 青，刘越美，唐燕萍

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

温阳振衰颗粒对阿霉素诱导慢性心衰兔心肌细胞外信号调节激酶5表达的影响

陈新宇1，蔡虎志2，史 微2，陈青扬2，卢 青1，刘越美1，唐燕萍2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 观察温阳振衰颗粒对阿霉素诱导慢性心衰模型兔心肌细胞外信号调节激酶5表达的影响。方法 健康新西兰兔60只，随机抽取15只为正常对照组，余45只兔耳缘静脉注射阿霉素4周后，先从中随机抽取13只为模型4周组，余下实验兔按心功能分层，随机分组，再随机分为模型8周组及各治疗组，各组用对应药物灌胃，连续4周。分别检测4、8周末兔心肌细胞外信号调节激酶5（ERK5）的总蛋白及蛋白磷酸化（P-ERK5）水平。结果 阿霉素造模后，模型4、8周组心肌P-ERK5水平均下调，两者较正常对照组差异有统计学意义（P＜0.05），且模型8周组较模型4周组下调更为明显（P＜0.05）；各组经药物干预4周后心肌P-ERK5水平较正常对照组仍明显下调（P＜0.05），但均高于模型8周组（P＜0.05），其中以阳性对照组和温阳高剂量组心肌P-ERK5水平升高最为明显（P＜0.05）；各组心肌ERK5水平相比差异无统计学意义。结论 温阳振衰颗粒能上调ERK5蛋白磷酸化的水平，从而激活ERK5信号转导通路，其中以高剂量温阳振衰颗粒最为明显，这可能是其调控慢性心衰时心室重构和心肌细胞凋亡的重要机制之一。

慢性心衰；温阳振衰颗粒；阿霉素；细胞外信号调节激酶5；蛋白磷酸化；心肌；兔

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种严重心脏疾病终末阶段所表现出来的一种临床综合征，是各种心血管疾病发展的终末阶段，已成为日益关注的最重要的心血管病症之一。现已基本明确CHF的发生、发展的分子学基础是心肌重构或心室重塑[1]。随着现代医学的发展，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)亦越来越受到研究人员的关注。MAPK级联信号转导途径存在于所有真核生物中，是细胞外各种信号刺激引起细胞分化、增殖和凋亡等多种反应的共同汇聚点或中枢。而其在心血管方面的作用也正被广泛地关注与研究[2-3]。细胞外信号调节激酶 5（mitogen-activated protein kinase5，ERK5）是MAPK家族中的一种非典型通路，有研究显示[4]，ERK5磷酸化（PERK5）的表达对正常心肌细胞的维护起双向调节作用，抑制其通路活性对病理状态下的心肌肥厚亦有抑制作用但同时也促进了心肌细胞的凋亡，因此ERK5的变化在CHF的发生、发展与转归的过程中可能具有重要作用。温阳振衰颗粒是临床治疗CHF的有效中药复方，也是作者的经验方，经前期研究显示其具有改善患者心功能及抑制细胞炎性因子的作用，但其作用机制有待进一步研究。本实验通过阿霉素复制慢性心衰动物模型，来探讨ERK5与慢性心衰的关系及温阳振衰颗粒治疗慢性心衰的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 健康雄性普通级新西兰兔60只，体质量（1.87±0.12）kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证批号:SCXK（湘）2009-0012。在自由饮食、光/暗周期为12 h/12 h（光照时间为6:00-18:00）、背景噪声为（40±10）db、温度（20±3）℃条件下饲养1周以适应环境。

1.1.2 主要药物与试剂 盐酸阿霉素 （深圳万乐药业有限公司，批号:201109，注射剂，规格10 mg/瓶）；温阳振衰颗粒 （湖南中医药大学第一附属医院制剂室，批号:201205，8 g/包）；依那普利片（辰欣药业股份有限公司，批号:201107，5 mg/片）；ERK5抗体（美国Santa Cruz公司，批号:H-300 sc-5626）；PERK5抗体（美国Santa Cruz公司，批号:Y220 sc-135761)。

1.1.3 主要仪器 Beckman LE-80K超速离心机（美国Beckman公司）；DYCZ-24F电泳仪（北京六一仪器厂）；NovaBlot转印仪 （美国GE healthcare公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 新西兰兔60只，随机抽取15只为正常对照组，将余下45只按文献报道方法[5]进行兔耳缘静脉注射阿霉素，4周后从存活的43只实验兔中随机抽取13只为模型4周组，检测其心肌ERK5及P-ERK5水平。余下30只实验兔按心功能分层后，再随机分为模型8周组、阳性对照组和温阳振衰颗粒低、中、高剂量组，每组6只。

1.2.2 CHF模型建立 参照张静等[5]方法，将注射用盐酸阿霉素用生理盐水稀释成1.0 mg/mL溶液，耳缘静脉注射，每次1.0 mL/kg，每周2次，连续8周。

1.2.3 给药方法 温阳振衰颗粒为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，规格为8 g/包，临床推荐成人起始剂量8 g/d，实验兔中药给药低剂量按成人70 kg起始剂量体表面积换算，低、中、高剂量按1∶2∶4倍计算。4周末经超声心动图检测提示各组造模成功后，自实验第5周起，温阳振衰颗粒低、中、高剂量组分别按0.4、0.8、1.6 g/（kg·d）配以蒸馏水10 mL进行灌胃，阳性对照组依那普利按5 mg/（kg·d）配以蒸馏水10 mL进行灌胃[6]，模型8周组灌服等量蒸馏水，各组连续灌胃4周。

1.3 样本采集与检测

1.3.1 心肌组织总蛋白质提取 将预处死兔麻醉后迅速取左室面心肌组织，置入液氮冻存。将冻结的心肌转移到预先称质量的离心管中，称出心肌的质量。按照约1∶8（质量∶体积）的比例加入组织裂解液混合后，冰浴上机械匀浆，涡旋混匀，静置1 h，21 000 r/min、4℃离心30 min，取上清即为组织的总蛋白质，Bradford方法测定蛋白质浓度，然后分装，-70℃保存备用。

1.3.2 ERK5和P-ERK5的指标检测 采用Western-blot检测，将50 μg心肌总蛋白加入2×SDS上样缓冲液 （0.1 mol/L Tris pH 6.8，0.2 mol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.02%溴酚兰)，100℃变性8 min，上样，恒定电流，前15 min 16 mA/gel电泳，然后32 mA/gel电泳至底部。电转印按照膜面积0.8 mA/cm2设定电流，转膜2 h。然后用含3%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。将膜取出，置于一杂交袋中，分别加入抗ERK5、p-ERK5抗体，4℃过夜。TBS-Tween 20漂洗10 min×3次，将膜取出，置于另一杂交袋中，加入酶标二抗(1∶2 000)，室温杂交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光显像，扫描(300 dpi)，保存，分析。ERK5值以吸光值1（Actin1）、P-ERK5值以吸光值2（Actin2）分别作为对照。

1.4 统计学分析

所有资料采用SPSS 17.0统计分析软件包进行处理，计量资料均采用“±s”表示，并进行正态性检验，多组均数组间比较采用单因素方差分析，显著性水准P<0.05。

2 结果

2.1 动物数量变化

造模后的45只新西兰兔分别于造模3、4周时因反复腹泻各死亡1只，4周末分组后模型8周组、阳性对照组和温阳中剂量组实验兔在实验结束前各死亡1只，考虑为阿霉素推注速度过快致急性中毒所致，正常对照组均生长良好。

2.2 温阳振衰颗粒对阿霉素诱导 CHF兔心肌ERK5表达的影响

实验结果显示:各组心肌ERK5水平相比差异无统计学意义（P＞0.05），提示各组心肌ERK5水平在阿霉素的诱导下无明显变化，温阳振衰颗粒亦不能对ERK5表达产生明显影响，见表1、图1。

2.3 温阳振衰颗粒对阿霉素诱导性CHF兔心肌PERK5表达的影响

实验结果显示:阿霉素造模后，模型4、8周组心肌P-ERK5水平均下调，两者较正常对照组差异有统计学意义（P＜0.05），且模型8周组较模型4周组下调更为明显（P＜0.05）。经阳性对照组及温阳各组治疗4周后心肌P-ERK5水平较正常对照组仍明显下调（P＜0.05），但均高于模型8周组（P＜0.05），其中以阳性对照组和温阳高剂量组心肌P-ERK5水平升高最为明显（P＜0.05），且两者P-ERK5水平相比无明显差异（P＞0.05）。提示温阳振衰颗粒可激活CHF模型兔心肌P-ERK5的表达，从而影响ERK5信号转导通路的活化，见表1、图1。

表1 温阳振衰颗粒对阿霉素诱导性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表达的影响 （s）

表1 温阳振衰颗粒对阿霉素诱导性CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表达的影响 （s）

注:与正常对照组比较#P＜0.05；与模型4周组比较△P＜0.05；与阳性对照组比较▲P＜0.05。

组别正常对照组模型4周组模型8周组阳性对照组温阳低剂组温阳中剂组温阳高剂组n 15 13 5 5 6 5 6 ERK5/Actin1 0.05±0.01 0.06±0.02 0.05±0.01 0.06±0.01 0.05±0.02 0.05±0.01 0.05±0.02 P-ERK5/Actin2 0.78±0.03 0.64±0.02#0.42±0.02#△0.53±0.03#△0.47±0.03#△▲0.48±0.02#△▲0.54±0.02#△

图1 各组阿霉素诱导CHF兔心肌ERK5、P-ERK5表达的电泳图

3 讨论

近年的研究表明MAPK信号转导通路异常是CHF的重要发病机制之一，目前，在哺乳动物细胞中发现了4条比较典型的MAPK信号通路:细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun N-末端激酶、P38激酶同工酶和ERK5。ERK5是MAPK家族中的一种非典型通路，主要定位于胞质，接受细胞外传来的信号并由其上游激酶MEK5激活，然后可转位于细胞核对转录因子心肌细胞增强子 （myocyte enhancer factor，MEF2）磷酸化而调节其转录活性。其信号通路与经典的MAPK通路一致，由胞外刺激→MAPKKK→MAPKK(MAPKK是ERK5唯一且特异性的上游激酶)→ERK5激活。最初的研究发现细胞因子如表皮生长因子、神经生长因子等能诱导激活ERK5，而ERK5可促进转录因子MEF2家族和cAMP应答元件结合蛋白 (camp responds element binding protein，CREB)的磷酸化，这些转录因子与细胞生存密切相关。ERK5还可以入核直接调节其他转录因子的表达，如c-Jun参与细胞周期的调控，而c-fos可介导ERK5的抗凋亡作用。研究发现ERK5与血管发育、增殖等功能密切相关[7]，自1995年由Zhou等[8]首次克隆后，已发现其控制着一系列原认为由ERK1/2完成的功能，并明确了在氧化应激、低氧、活性氧簇以及各种丝裂原的激动下，在保持血管完整和细胞生长中起到重要作用。Regan等[9]研究发现，ERK5小鼠缺陷模型表现出多种胚胎外血管和胚胎心血管发育迟缓，表明ERK5在心血管发育中起着极其重要的作用。Hayashi[10]等也发现，敲除成年小鼠ERK5基因后，小鼠在2～4周内死亡。本实验结果说明经阿霉素造模后，模型4、8周组心肌P-ERK5水平均下调，两者较正常对照组差异有统计学意义，且模型8周组较模型4周组下调更为明显。经阳性对照组及温阳各组治疗4周后心肌P-ERK5水平较正常对照组仍明显下调，但均高于模型8周组，其中以阳性对照组和温阳高剂量组心肌P-ERK5水平升高最为明显，且两者P-ERK5水平相比无明显差异。但各组心肌ERK5水平相比差异无统计学意义，这提示温阳振衰颗粒可激活CHF模型兔心肌PERK5的表达，从而影响ERK5信号转导通路的活化，这其中以高剂量温阳振衰颗粒最为明显。

温阳振衰颗粒以温阳益气、利水消肿为其基本功效，药物主要由附片、干姜、红参、甘草等组成。其中附片有回阳救逆，助阳补火的作用，其性纯阳无阴，刚烈迅捷，走而不守，能通上达下，行表彻里，通行十二经脉，乃治疗阳衰阴盛、水湿肿满等病症之要药，亦为中医治病救命之第一品药。干姜能温中散寒，回阳通脉。《本草求真》云:“干姜大热无毒，守而不走，凡胃中虚冷，元阳欲觉，合以附子同投，则能回阳立效”，古医书有“附子无姜不热”之句。红参为人参蒸制后干燥者，性微温，味甘，大补元气，补脾益肺。甘草味甘性平，能益气补中，调和诸药，此方中还可以减轻附片的毒性作用。诸药合用，共奏温阳益气、利水消肿之功。通过前期研究发现温阳振衰颗粒对于治疗CHF显示出良好的临床疗效，能显著改善心功能，且可降低血清肿瘤坏死因子-a、内皮素-1水平，上调白细胞介素-10水平[11]。还可降低血浆血管紧张素Ⅱ、心房利钠肽水平[12]。在心肌细胞凋亡检测中，能降低心肌细胞凋亡阳性面密度比值，对心肌细胞起到明显保护作用[13]。本研究结果则进一步提示，温阳振衰颗粒可能通过上调CHF模型兔心肌组织ERK5蛋白的磷酸化，从而激活ERK5信号转导途径的活化，进而对心肌重塑和心肌细胞凋亡起到调控作用。

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（本文编辑 徐爱良）

Effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin

CHEN Xinyu1，CAI Huzhi2，SHI Wei2，CHEN Qingyang2，LU Qing1，LIU Yuemei1，TANG Yanping2
(1.First Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410007,China;
2.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To elucidate the effects of Wenyang Zhenshuai Granule on the expression of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) of the myocardial tissue in rabbit model with chronic heart failure induced by adriamycin.Methods 15 rabbits were randomly extracted from 60 rabbits for the control group,13 rabbits were randomly extracted from other 45 rabbits after modeled by intravenous injection of adriamycin for 4 weeks,which is named model 4 weeks group.The rest rabbits were randomly divided into 5 groups including the model 8weeks group and the 4 medicine treatment groups.Each medicine group was given enalapril (positive control)or Wenyang Zhenshuai Granule high dose,medium dose and low dose by gastric administration for 4 consecutive weeks.The expression levels of ERK5 and P-ERK5 in all groups were detected by western blotting.Results P-ERK5 expression levels in myocardial tissue of model 4 and 8 weeks groups were lower than that in control group(P<0.05),and its down-regulation in model 8 weeks group was marked than that of model 4 weeks group.4 weeks after treatment, P-ERK5 expression levels in all medicine treating groups were lower than that of control group, but significantly higher than that of model 8 weeks group(P<0.05).Among of them,up-regulation of P-ERK5 in the positive control group and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group were more obviously(P<0.05).There were no significant differences in ERK5 proteins among these groups.Conclusion Wenyang Zhenshuai Granule can promote the level of p-ERK5 protein, then activate ERK5 signal transduction pathway, and Wenyang Zhenshuai Granule high dose group has more significant effects than other two doses groups,which may be one of the mechanisms of Wenyang Zhenshuai Granule regulating the ventricular remodeling and the apoptosis of myocardial cells in chronic heart failure.

chronic heart failure;Wenyang Zhenshuai Granule;adriamycin;ERK5;protein phosphorylation;myocardial tissue;rabbit

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.004.014.05

2013－11－17

国家自然科学基金资助项目 （81173213/H2708）；湖南省科技厅科技计划项目 （2011FJ3042）；湖南省中医药管理局重点项目（201106）；湖南省研究生科研创新项目（CX2011B341）。

陈新宇，男，教授，医学博士，博士研究生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病的研究。