咳喘宁雾化吸入对哮喘大鼠肺泡灌洗液白介素-5与嗜酸性粒细胞的影响

吴文娟，董晓斐*，李娇艳，陈春辉，周娅薇

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

咳喘宁雾化吸入对哮喘大鼠肺泡灌洗液白介素-5与嗜酸性粒细胞的影响

吴文娟，董晓斐*，李娇艳，陈春辉，周娅薇

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 观察咳喘宁雾化吸入对肺泡灌洗液（BALF）中白介素-5（IL-5）表达、嗜酸性粒细胞（EOS）计数的影响，探讨其对哮喘大鼠气道炎症的作用机制。方法 将SD雄性幼龄大鼠40只，随机分为正常组、哮喘模型组、咳喘宁干预组、布地奈德干预组，每组10只。经鸡卵蛋白（OVA）致敏后，给予OVA雾化吸入诱发哮喘发作，制作哮喘模型。咳喘宁干预组与布地奈德干预组分别给予咳喘宁口服液1.7 g/kg，布地奈德0.1 mg/kg，正常组与哮喘模型组予以等量生理盐水雾化。雾化7 d后，处死大鼠，检测大鼠BALF中IL-5水平和EOS计数。结果 咳喘宁干预组大鼠BALF中的IL-5与EOS明显低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P<0.05），与布地奈德干预组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 咳喘宁通过雾化吸入能降低哮喘大鼠BALF的IL-5水平及EOS计数，从而改善哮喘大鼠气道炎症状态。

哮喘；咳喘宁；雾化吸入；白介素-5；嗜酸性粒细胞；大鼠

支气管哮喘（简称哮喘）是气道的炎性细胞和结构细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]，是儿童时期最常见的呼吸道慢性疾病，其急性发作，是严重威胁患者生命的临床急症之一。气道非特异性炎症是哮喘基本病理特点。吸入糖皮质激素已公认为有效的抗炎手段，但因为激素具有全身副作用而不能长期使用。目前中药雾化吸入引入哮喘治疗，多项临床研究证实，在常规治疗基础上结合中药雾化，比单纯用西药治疗效果好[2-3]。咳喘宁作为我院自制药，临床研究及动物实验均表明它对哮喘有较好疗效。为进一步研究其防治哮喘的机制，本文采用雾化给药途径，探讨咳喘宁雾化吸入对哮喘大鼠气道炎症的影响，为哮喘急性发作治疗提供一定实验依据。现将方法及结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号:SCXK（湘）2011-0003，28～42 d，体质量（120±20）g，正常饲养1周后开始实验。

1.1.2 药物 咳喘宁由炙麻黄、苦杏仁、桃仁、大青叶、黄芪、生石膏、细茶叶和甘草等中药组成，湖南中医药大学第一临床医学院制剂室提供，批号: 20120510，采用自动煎药机煎后密封包装，每包100 mL，每毫升含生药1 g。

1.1.3 试剂与仪器 吸入用布地奈德混悬液（Astra Zeneca Pty Ltd公司生产，规格:2 mL/支，批号: X20010423）；白介素（IL-5）、酶联免疫（ELISA）试剂盒 （武汉博士德公司生产，批号:20121013）；402AI医用超声雾化吸入器 （上海四菱医用恒温设备有限公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 取40只雄性大鼠，按随机排表分为4组，每组10只，取1组作为正常组，其余大鼠均参照吕国平等[4]方法复制为哮喘模型。造模方法:分别于第1和第8天，分别向腹腔注射共1 mL含1 mg鸡卵蛋白（OVA）和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原致敏，第9天至21天雾化吸入OVA，每日1次，每次30 min，连续2周，以出现明显点头样呼吸，腹肌抽搐，甚至站立不稳而扑倒时即为哮喘急性发作，提示造模成功[4]。将造模成功大鼠分为3组，每组10只，分别为哮喘模型组、咳喘宁干预组、布地奈德干预组。正常组大鼠于第1天和第8天向腹腔注射1 mL生理盐水，第9～21天雾化吸入等量生理盐水。

1.2.2 给药方法 造模成功后当天进行给药，每天雾化2次，每次20 min，连续雾化7 d。按照《药理学实验方法》[5]，人与动物等效剂量换算方法，各组药物用量如下:咳喘宁干预组以咳喘宁1.7 g/（kg·次），溶于20 mL生理盐水中雾化；布地奈德干预组以0.1 mg/（kg·次），溶于20 mL生理盐水中雾化，正常对照组与哮喘模型组以等体积生理盐水雾化。

1.3 标本采集与检测

1.3.1 肺泡灌洗液（BALF）IL-5水平检测 末次雾化后，以10%水合氯醛向腹腔注射麻醉大鼠后，股动脉放血处死。打开胸腔暴露肺脏，结扎右侧肺门，分离出颈部气管，并做气管切开插管固定。用生理盐水2 mL注入肺内，停留30 S后回抽灌洗液。重复上述操作3次，记录回收液体量。1 000 r/min离心15 min，离心后取上清液0.5 mL，置于-70℃冰箱内，用于IL-5检测。

1.3.2 采用ELISA法检测IL-5嗜酸性粒细胞（EOS）的计数 取上述步骤中获得BALF离心细胞沉淀，采用血细胞分析仪计算大鼠BALF的EOS计数。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 咳喘宁对大鼠BALF中IL-5的影响

哮喘模型组BALF中IL-5高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05），提示造模成功。咳喘宁干预组和布地奈德干预组的BALF中IL-5均低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；布地奈德干预组BALF中IL-5低于咳喘宁干预组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 咳喘宁对大鼠BALF中EOS的影响

正常组BALF未检测到 EOS。哮喘模型组BALE中EOS高于正常组，差异有统计学意义（P< 0.05）。咳喘宁干预组和布地奈德干预组的BALF中EOS均低于哮喘模型组，差异有统计学意义 （P< 0.05）；布地奈德干预组与咳喘宁干预组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 咳喘宁雾化吸入对哮喘大鼠BALF中IL-5水平与EOS计数的影响 （n=10，±s）

表1 咳喘宁雾化吸入对哮喘大鼠BALF中IL-5水平与EOS计数的影响 （n=10，±s）

注:与哮喘模型组比较*P<0.05；与咳喘宁干预组相比▲P>0.05。

组别正常组哮喘模型组咳喘宁干预组布地奈德干预组剂量（g/kg）——1.7 0.000 1 IL-5(IU/L) 5.62±0.42* 8.59±0.33 7.47±0.45* 6.95±0.20*▲EOS(×108/L) 0 1.07±0.22 0.29±0.13* 0.34±0.10*▲

3 讨论

哮喘是多种细胞因子和多种细胞介导的呼吸道慢性炎症。多种细胞浸润及细胞因子的异常分泌是哮喘发病机制。IL-5等细胞因子的异常增高在哮喘多种病理改变中起着不可替代的作用，尤其在协调和促进以EOS为基础的炎性过程中起着关键作用[6]。哮喘患者支气管肺组织内大量炎性细胞浸润，以EOS增多最为显著。临床研究表明哮喘急性发作时，气道EOS可作为急性发作期诊断依据[7]。IL-5是一种EOS分化因子，被认为是EOS活化、成熟、趋化、存活和募集至气道不可缺少因子[8]。研究证实IL-5可使气道变态反应性炎症中EOS数目增多和活性增强，诱导EOS的前体生长和分化，对成熟EOS也有趋化和激活作用。而抗IL-5治疗可抑制EOS在气道的浸润，从而减轻气道炎症[9]。

中医学认为，哮喘为内有痰饮留伏、外因邪气引动而诱发，病位在肺。咳喘宁由五虎汤和截哮口服液（我院自制药）二方化裁而成。方中麻黄、苦杏仁宣降肺气，通畅气道，从而降低气道反应性，共为本方君药；黄芪扶正祛邪，石膏清泄肺热，大青叶清热抗炎，具有抗病毒，共为臣药；桃仁活血化瘀以改善微循环、改善炎症病灶，细茶叶清神化痰，甘草镇咳平喘，具有抗炎、抗变态反应作用，共为本方佐使。诸药合用，共奏清热解毒、扶正化痰、宣畅郁闭之肺卫气机、清除哮喘激发因素、降低气道反应性等功效，能有效地治疗哮喘[10]。动物试验中发现咳喘宁能降低肺组织中EOS浸润，降低气道反应性和平滑肌收缩程度，缓解支气管痉挛[11]。本实验在此基础上，从IL-5和EOS探讨咳喘宁防治哮喘机制，主要通过雾化给药来治疗哮喘。雾化吸入能使药物直达病所，同时通过“肺朝百脉”而输布全身，进而改善机体血液循环，消除支气管黏膜水肿，解除气道痉挛，使症状减轻，具有作用直接、起效快、用药量少，全身不良反应小的优点。王妍炜等通过临床试验发现中药雾化吸入治疗能有效地控制小儿哮喘发作期的症状和体征，改善通气功能，并缩短疗程[2]。目前中药雾化已逐步引入哮喘治疗。本实验发现经过咳喘宁雾化治疗哮喘大鼠BALF中IL-5与EOS水平低于模型组，差异有统计学意义，与布地奈德干预组比较，差异无统计学意义。在既往研究基础上，咳喘宁雾化能降低BALF中IL-5和EOS水平，改善哮喘大鼠气道炎症，为中药雾化防治哮喘提供一定的实验依据。

[1]林燕萍.支气管哮喘防治指南[G].西安第四届中国中西医结合学会变态反应学术大会论文汇编，2009:94-97.

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[3]张少华.中药雾化吸入治疗哮喘急性发作28例疗效观察[J].四川中医，2004，22（5）:41-43.

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[5]徐叔云，卞如濂，陈 修.药理学实验方法[M].北京:中国医药科技出版社，1991:178-179.

[6]杨 海，杨小兰，陈远东，等.检测诱导痰嗜酸性粒细胞在哮喘病情评估的应用[J].实用医学杂志，2012，28（6）:993-994.

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[10]王孟清，罗银河，陈锡军，等.咳喘宁治疗病毒诱发小儿哮喘的临床研究[J].新中医，2007，39（4）:16-17.

[11]董晓斐，罗银河，王孟清，等.咳喘宁对哮喘豚鼠EOS的调节作用[J].湖南中医药大学学报，2008，28（5）:36-37.

（本文编辑 徐爱良）

Effects of Kechuanning by atomization inhalation on IL-5 expression and EOS in Bronchoalveolar lavage fluid of asthma SD rats

WU Wenjuan,DONG Xiaofei,LI Jiaoyan,CHEN Chunhui,ZHOU Yawei
(First Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effects of Kechuanning(KCN)by atomization inhalation on the expression of interleukin 5(IL-5)and eosinophil(EOS)count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)in asthmatic SD rats,and explore the mechanism of KCN on airway inflammation of asthmatic SD rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into normal group, asthmatic group,KCN group and budesonide group with 10 rats in each group.The asthmatic model was established by sensitizing and challenging SD rats with aerosolized ovalbumin (OVA).KCN group rats were treated with 1.7 g/kg KCN by atomization inhalation, budesonide group rats were treated with 0.1 mg/kg budesonide,normal group and asthmatic group rats were treated with equal amount of saline.After treatment for a week,the rats were killed and theIL-5inBALF wasmeasuredby enzymelinkedimmunosorbentassay,EOS countwas also carried out.Results The IL-5 and EOS of BALF in the KCN group rats were markedly lower than those in asthmatic group(P<0.05).The differences between the KCN group and the budesonide group were not marked (P>0.05). Conclusion KCN by atomizationinhalation can decrease the levelofIL-5 and EOS in BALF,and then improve airway inflammation of asthmatic rats.

asthma;Kechuanning;atomization inhalation;interleukin 5;eosinophil;rat

R272，R725.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.005.019.03

2013－10－08

湖南省科技厅科研资助项目（2013SK3087）；研究生创新课题（CX2012B346）；湖南省教育厅科研资助项目（11B094）。

吴文娟，女，在读硕士研究生，研究方向:小儿肺系疾病与新生儿疾病。

*董晓斐，女，副主任医师，E-mail:dxf3204@163.com。