土壤中一株产黑色素微生物的分离与鉴定

阎春兰，代金刚，王恒涛，邱裕尧，王 茜

(中南民族大学 生命科学学院，微生物与生物转化重点实验室 武汉 430074)

黑色素是一种广泛存在于动物、植物和微生物中，颜色从棕色到黑色，结构较为复杂的非均质类多酚聚合体.这种色素并非对生物的生长和发育必不可少，但却能够提高生物的生存和竞争能力[1].黑色素应用潜力巨大，作为紫外线吸收剂、自由基清除剂、抗氧化剂、无定形的半导体、生物杀虫剂的光保护剂和新型的天然药物载体，可用于治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病.近年来发现一些可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用，使天然黑色素可望成为一种新的抗艾滋病药物[2，3].

为获得高产胞外黑色素的优良菌株，本文从土壤中分离筛选得到一株产黑色素链霉菌，并研究和鉴定了其产黑色素性质和部分生理生化特征，为后期优化产黑色素的条件提供了良好的理论基础.

1 材料和方法

1.1 材料

实验中所用土壤来自中南民族大学校园.培养基：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2). pMD18-T载体、Taq聚合酶(Takara公司)，T4 DNA连接酶(MBI生物公司)，16S rDNA 的测序(北京三博远志公司).UV757CRT紫外可见分光光度计(UV757CRT，上海精密科学仪器有限公司). PCR仪(T-personal 48, Biometra公司).

1.2 方法

土壤中的微生物采用稀释涂布平板法，对稀释涂布平板法得到的单菌落，通过平板划线分离法进行纯化.将纯化的菌体振荡培养至对数期，离心收集菌体，抽提基因组DNA. PCR扩增菌体基因组16S rDNA.引物16S-F： 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物16S-R ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′.PCR程序参考文献[4]，PCR 扩增产物经用琼脂糖凝胶回收后，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞.通过Blast程序，将由北京三博远志公司所测得的16S rDNA 序列与 GeneBank 数据库中的16S rDNA 序列进行相似性比较分析，选取同源性高的菌株用于系统发育树的构建.采用Mega 2.0程序进行系统发育树分析.

将对数生长期的菌株按5%接种到30 mL 牛肉膏蛋白胨培养液中，28℃摇床振荡培养，分别在0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h 后，离心取样，将沉淀在55℃烘干至恒重，称量干重后，绘制菌株的生长曲线.

采用四环素(Tc)、氨苄青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)、庆大霉素(Gm)、链霉素(St)、壮观霉素(Sp)、氯霉素(Cm)共7种抗生素对细菌的抗生素抗性进行了测定. 利用发酵液在UV757CRT紫外可见分光光度计上于200～800 nm内扫描测定菌株所产黑色素的吸收光谱[5]. 参照文献[6]测定菌株所产黑色素的抗辐射能力.

2 结果与分析

2.1 菌落形态特征与鉴定

经稀释涂布平板法分离、平板划线纯化后，从土壤中得到了4株产黑色素的菌株，其中D-1产黑色素能力较强(见图1).D-1在培养基上菌落表面成粉末状，干燥、不透明、边缘整齐，与培养基结合紧密，难于挑取.镜检结果为丝状体，有孢子.

1) 产黑色素的菌液; 2) 未接种菌株的培养基图1 菌株D-1产黑色素的菌液Fig.1 Bacterial liquid of melanin-producing microorganism D-1

将D-1菌株的16S rDNA部分序列与Genbank基因库中已知的16S rDNA序列同源性比较发现：菌株D-1与Streptomyces链霉菌属的多个菌株的序列相似性均达到了99%以上.

2.2 系统发育分析

从系统进化树中(图2)可见，从GenBank中搜索得到与D-1同源性在99%以上的12个菌株中，D-1属于Streptomyces链霉菌属，但与其他链霉菌属菌株存在较大差异.结合菌株的形态和16S rDNA 部分序列的比对结果，确定菌株D-1属于链霉菌属(Streptomyces).在系统发育地位上则属于：Bacteria，Actinobacteria，Actinobacteria，Actinomycetales，Aptomycetaceae，Streptomyces.

图2 菌株D-1的16S rDNA序列的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of D-1 based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株的黑色素的紫外可见光吸收光谱

将菌株所产生的黑色素菌液经牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释后在紫外可见分光光度计上进行200～800 nm区间吸收峰的连续扫描，扫描结果见图3.由图3可见，菌株所产黑色素在240～250nm处有一个强吸收峰，在可见光区域内没有特征吸收峰，吸收度随波长的增大而减少，与文献报道的黑色素的吸收光谱相吻合[5].

λ/nm图3 菌株D-1所产黑色素的紫外-可见光吸收光谱Fig.3 The absorption spectrum of melanin produced by D-1

2.4 生长曲线的测定

37℃下将菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，分别在0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h 后离心取样，将沉淀在55℃烘干至恒重，称量干重后绘制生长曲线如图4.由图4可见，菌株在12～48h之间生长迅速，在约48 h进入平台期，随后细胞数量略有所下降.

图4 菌株D-1的生长曲线Fig.4 The growth curve of strain D-1

2.5 抗生素抗性的测定

采用多种抗生素对菌株D-1进行检测，结果见表1.由表1可见，St50、Km20、Sp10、Gm5对D-1均有很好的抑制作用，即终浓度分别为50 μg·mL-1的链霉素、20 μg·mL-1的卡那霉素、10 μg·mL-1的壮观霉素、5 μg·mL-1的庆大霉素均能抑制这种微生物的生长，而2 μg·mL-1的四环素和氯霉素对该菌均无抑制作用，20 μg·mL-1的氨苄青霉素对该菌具有部分的抑制作用.

表1 菌株D-1的抗生素抗性

-: 菌种不能生长; +: 菌种可以生长

2.6 黑色素对菌株的保护作用

以常见菌种大肠杆菌为检测菌，测定了D-1所产的黑色素对紫外线的抗辐射能力，结果见图5.由图5可见，紫外线照射5 min 后，对照组中大肠杆菌被杀死的达到88.72 %，仅11.28 %存活，而加入了D-1所产黑色素的大肠杆菌，大肠杆菌被杀死的仅为6.84 %，有93.16 %的大肠杆菌存活；紫外线照射10 min 后，对照组中95 %的大肠杆菌被杀死，处理组中仍有接近16 %的大肠杆菌存活.紫外线照射15 min 后，对照组中的大肠杆菌存活的仅为0.5 %，处理组中还有7.88 %的大肠杆菌存活.由此可见，D-1所产的黑色素可抵抗紫外线的辐射作用，使得被测菌株的存活率明显提高.这与蔡信之[6]将含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒转入类产碱假单胞菌中获得的重组子所产生的黑色素的抗辐射能力相当.

图5 紫外线照射下不同时间的菌体存活率 Fig.5 Survival rates of bacterium by radiating of ultraviolet rays in different time

3 结语

黑色素应用潜力巨大，从动物或植物体内提取黑色素，因生产过程繁琐、生产成本高等缺点难以大规模生产，而微生物资源丰富，生产工艺简单，便于实现工业化生产，故利用微生物发酵黑色素技术的研究越来越得到重视.本文从土壤中分离得到了一株产黑色素的菌株，其所产黑色素的吸收光谱与多篇文献报道的黑色素的吸收光谱相吻合，具有明显的保护作用，可保护机体免受紫外线的辐射伤害.根据菌株的形态特征并结合16S rDNA序列比对分析确定该菌株为属于链霉菌属(Streptomyces).本文为后期优化产黑色素的条件提供了理论基础.

参 考 文 献

[1] 陈雪峰, 苏桂锋, 周庆礼. 我国黑色素微生物资源的研究现状[J]. 食品工业科技, 2008(6) : 318-320.

[2] 李建波, 宋 欣, 曲音波. 产胞外黑色素菌株的筛选[J]. 微生物学通报, 2004, 31(1): 50-54.

[3] Langfelder K, Streibel M, Jahn B, et al. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pahtogenic fungi [J]. Fungal Genet Biol, 2003 (38): 143-158.

[4] 程国军，杨 凯，李友国.一株降解苯酚微生物的分离与鉴定[J].湖北农业科学，2008，47(2)：792-793.

[5] 叶 明,许庆平,陈 晓,等. LachnumYM-223 产黑色素发酵及其黑色素抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2009, 30(17): 185-189.

[6] 蔡信之. 类产碱假单胞菌酪氨酸酶基因重组子所产黑色素性质的研究[J]. 微生物学报, 2001, 41(6): 699-703.