光谱法研究EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白的相互作用*

赵丽丽， 田 淼， 冯 洁， 赵玉玲

(1.浙江中鼎检测技术有限公司，浙江 义乌 322000；2.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

血清白蛋白是一种球蛋白，可以与无机离子、有机化合物及小分子药物等结合，在生物体内发挥重要的作用[1-3].铁作为人体内最丰富的过渡金属和微量元素之一，主要通过与血清白蛋白的相互作用发挥其生物效应[4-5].EDTA-Fe(Ⅲ)是乙二胺四乙酸铁钠(sodium iron EDTA)的重要成分，其中的铁元素能够被血液很好地吸收，在补铁方面具有独特的优势[6].我国已于2002年批准将EDTA铁钠用于强化酱油，以此改善人们的生活质量.

紫外光谱和荧光光谱是研究生物大分子与小分子相互作用的重要手段[7-9].通过研究小分子微扰的蛋白质光谱变化，可以推断生色基微环境及蛋白质结构的变化，并且可以推断小分子物质与蛋白质的结合情况.但是，紫外光谱由电子跃迁产生，得到的是宽阔的谱带，难以分辨蛋白质中氨基酸残基吸收谱带的振动结构.而荧光光谱则是研究蛋白质分子构象的一种有效方法，通过结合常数、结合位点数、结合距离、能量转移效率及蛋白质构象等的测定，可以进行定性、定量研究.本文应用紫外光谱和荧光光谱技术对EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白之间的相互作用进行了研究.

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

Shimadzu UV-2501PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；PE LS-55荧光分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；赛多利斯电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；微量注射器(上海光正医疗仪器有限公司).

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)购自华美生物工程公司；柠檬酸铁(ferric citrate)和乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)购自上海国药集团；盐酸(HCl)、氯化钠(NaCl)和氢氧化钠(NaOH)均为分析纯试剂.实验用水为亚沸蒸馏去离子水.

1.2 溶液配制

配制50 mmol/L Tris-HCl并含100 mmol/L NaCl的缓冲溶液，维持体系的pH=7.0和离子强度，并以此缓冲溶液配制牛血清白蛋白(BSA)储备液.

加热柠檬酸铁溶液至沸腾，慢慢加入Na2EDTA溶液，且不停地搅拌，得到黄色的EDTA-Fe(Ⅲ)溶液.制备过程中的副产物柠檬酸钠盐在测定波长下对EDTA-Fe(Ⅲ)的紫外吸收光谱和荧光发射光谱(数据未列出)没有影响.

1.3 测定方法

在一系列5 mL比色管中，依次加入牛血清白蛋白溶液和EDTA-Fe(Ⅲ)溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，分别测定：1)310 K温度下的紫外光谱；2)293 K和313 K温度下的荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质物质的量比为1∶1的EDTA-Fe(Ⅲ)的吸收光谱.测定中固定牛血清白蛋白的浓度为1.87×10-7mol5L-1,仅改变EDTA-Fe(Ⅲ)的浓度.

2 结果与讨论

2.1 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的紫外光谱

牛血清白蛋白在紫外区的特征吸收峰位置为280 nm波长附近，主要是色氨酸残基、酪氨酸残基和苯丙氨酸残基的吸收引起的.当小分子物质与牛血清白蛋白结合时，会导致牛血清白蛋白吸收光谱的强度和谱带位置发生变化.若蛋白质的吸收峰增强，则可认为小分子物质进入了蛋白质的疏水腔，导致肽链伸展，疏水环境下降[10].随着EDTA-Fe(Ⅲ)浓度的增加，牛血清白蛋白在278 nm波长的最大吸收峰逐渐增强，且峰位轻微蓝移(见图1).而EDTA-Fe(Ⅲ)在该波长范围内没有吸收(数据未列出).由此推

a→f分别为c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0

测EDTA-Fe(Ⅲ)进入了蛋白质的疏水腔，导致肽链伸展，疏水环境下降，深埋于蛋白质非极性区的生色基被暴露于极性溶剂.紫外光谱分析结果表明，EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白发生了相互作用，但具体的作用力类型及对蛋白质结构的影响需要通过荧光光谱分析来确认.

2.2 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的荧光猝灭

a→h分别为c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0

固定激发波长为280 nm，扫描波长300～500 nm的荧光光谱.结果发现：EDTA-Fe(Ⅲ)在300～500 nm不发射荧光(数据未列出)；牛血清白蛋白在波长344.5 nm处有最大荧光发射峰，主要来自色氨酸残基和酪氨酸残基；EDTA-Fe(Ⅲ)的加入使牛血清白蛋白的最大荧光发射峰产生有规律的猝灭，发射波长轻微蓝移，峰形保持不变(见图2).说明EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白发生了作用，出现了典型的荧光猝灭现象.

荧光体与猝灭体相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分：动态猝灭是由荧光体与猝灭体之间的碰撞作用导致的；静态猝灭则是由猝灭体与荧光体之间形成不发荧光的基态配合物所导致的.通常先假设为动态猝灭，服从斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)方程[11]

(1)

式(1)中:F0为猝灭体不存在时荧光体的荧光强度;F为猝灭体加入后的荧光强度;Kq为双分子猝灭常数;[Q]为猝灭体的浓度;τ0为猝灭体不存在时荧光体的荧光寿命；KD为Stern-Volmer常数.对F0/F与[Q]进行线性拟合，得到一条直线，由直线斜率求出KD/(L5mol-1)=9.05×103(见图2(a))，1.02×104(见图2(b)).由于荧光平均寿命大约为10-8s[12]，因此可求得猝灭常数Kq/(L5mol-15s-1)=9.05×1011(见图2(a))，1.02×1012(见图2(b)).当猝灭剂对蛋白质的扩散碰撞猝灭常数超过2.0×1010(L·mol-1·s-1)时为静态猝灭[12].显然,由图2知EDTA-Fe(Ⅲ)对牛血清白蛋白荧光的猝灭常数大于扩散控制猝灭常数，说明2个温度下EDTA-Fe(Ⅲ)对牛血清白蛋白的荧光猝灭是形成基态复合物所引起的静态猝灭.

图3 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的荧光猝灭对数曲线

2.3 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的结合常数和结合位点数

如果小分子在蛋白质上有n个相同且独立的结合位点，有公式[13]

(2)

表1 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的结合常数和结合位点数

2.4 牛血清白蛋白与EDTA-Fe(Ⅲ)之间的能量转移及结合距离

当蛋白分子的发射光谱与小分子物质的吸收光谱相互重叠时，通过共振偶合可使能量从给体转移到受体.依据福斯特(Forster)共振能量转移理论[11]，可以求出小分子物质与蛋白质中色氨酸残基的结合距离，由结合距离的变化分析小分子物质对蛋白质构象的影响.Forster共振能量转移理论可表示为[11]：

ФJ;

(4)

(5)

式(3)中:E为能量转移效率;r为小分子与蛋白质的结合距离;R0为转移效率为50%时的临界距离[11].式(4)中:K2=2/3,为偶极空间取向因子;N=1.36,为介质的折射指数;Φ=0.118,为授体的荧光量子产率;J为授体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的光谱重叠积分[14].式(5)中:F(λ)为荧光授体在波长λ处的荧光强度；Δλ为荧光光谱和紫外吸收光谱中的波长间隔;ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔消光系数[14].由于在280 nm激发波长下牛血清白蛋白的最大发射峰出现在344.5 nm处，且在其他区域并未发现荧光发射峰的出现，因此，测定了在波长300～370 nm EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白以1∶1的分子比结合时的紫外吸收光谱及牛血清白蛋白荧光发射光谱的重叠光谱(见图4).参照文献[15]，分别求得R0,E和r，数值列于表2.

牛血清白蛋白有2个色氨酸残基，分别位于第134位和212位，而在实验条件(λex=280 nm，λem=335 nm)下，位于牛血清白蛋白疏水腔内第212位的色氨酸残基对牛血清白蛋白的荧光贡献最大.通常，当结合部位与氨基酸残基之间的距离小于7 nm时有能量转移发生.如果结合距离大于临界距离，可推测能量转移不是引起蛋白质荧光猝灭的主要原因，其主要原因是静态猝灭[14].因此，从r(4.80 nm和5.06 nm)均小于7 nm但大于R0(2.85 nm)推测，EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用过程中发生了能量转移，但是能量转移并不是引起牛血清白蛋白荧光猝灭的主要原因，其主要原因是静态猝灭[15].

a:牛血清白蛋白的荧光发射光谱;b:EDTA-Fe(Ⅲ)的紫外吸收光谱

表2 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白相互作用的相关数据

2.5 EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白之间的相互作用力

小分子物质和蛋白质之间的作用力主要有氢键和范德华力、静电作用力、疏水作用力.通过比较反应前后热力学焓变(ΔH)和熵变(ΔS)的相对大小，能够判断小分子和蛋白质之间的主要作用力类型.若ΔH>0，ΔS>0，则为疏水作用力；若ΔH<0，ΔS>0，则为静电作用力；若ΔH<0，ΔS<0，则为氢键和范德华力[16].根据热力学知识，ΔH基本不随温度的变化而变化，可看作是一常数.由热力学公式[16]

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R,

(6)

ΔG=-RTlnK,

(7)

ΔS=(ΔG-ΔH)/T，

(8)

再依据EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白在不同温度下的结合常数，求得：ΔH=-20.51 KJ5mol-1，ΔS=-4.57 J5mol-1K-1.因此，EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白之间的相互作用力主要为氢键和范德华力.

2.6 EDTA-Fe(Ⅲ)对牛血清白蛋白构象的影响

固定波长的同步荧光光谱常用于判断蛋白质构象的改变.Δλ=15 nm时扫描显示酪氨酸残基的荧光，Δλ=60 nm时扫描显示色氨酸残基的荧光[11].扫描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm时EDTA-Fe(Ⅲ)-BSA相互作用的同步荧光光谱(见图5)，发现：牛血清白蛋白的荧光主要由色氨酸残基贡献；随着EDTA-Fe(Ⅲ)浓度的增加，酪氨酸残基的发射波长及峰型基本不变，而色氨酸残基的发射波长轻微蓝移.说明EDTA-Fe(Ⅲ)的加入使得蛋白质中色氨酸残基的疏水性增强，从而导致蛋白质的构象发生改变[17].

3 结 论

EDTA-Fe(Ⅲ)可以进入牛血清白蛋白的疏水腔，使蛋白质非极性区的生色基暴露于极性溶剂.EDTA-Fe(Ⅲ)对牛血清白蛋白的荧光猝灭属于静态猝灭；EDTA-Fe(Ⅲ)与牛血清白蛋白以氢键和范德华力相结合，且形成了较稳定的1∶1型复合物；EDTA-Fe(Ⅲ) 的加入使牛血清白蛋白中色氨酸残基的疏水性增强，进而导致蛋白构象发生改变.

a→h分别为c(EDTA-Fe(Ⅲ))/(10-6 mol5L-1)=0,2.5,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0

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