慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究*

赵铁军， 倪伟海， 郑有芳， 郭一孚， 蒋欢乐， 徐 怡

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

慢病毒(lentivirus)属逆转录病毒科(Retrovidae)，它主要包括8种能够感染人和脊椎动物的RNA病毒.此类病毒的共同之处在于它们都具有逆转录病毒的基本结构和特性[1].慢病毒载体(lentiviral vector，LV)系统是以慢病毒基因组为基础、人工改造构建而成的一种病毒载体.它利用慢病毒的高感染性、高表达性、可感染分裂细胞和非分裂细胞等诸多特性，通过感染细胞或组织，实现外源基因在细胞或组织中持续稳定的表达[2].由于具有上述优点，慢病毒载体作为一种新型的生物资源已成为当前生物及医学相关领域的研究热点[3].

1 慢病毒载体

1.1 慢病毒载体的构建

应用最为广泛的慢病毒载体系统包含整合质粒、包装质粒和包膜质粒.整合质粒主要含有包装、逆转录及整合所必须的作用原件，而且具有多克隆位点，及插入到该位点的目的基因.包膜质粒和包装质粒构成了慢病毒载体的包装系统，它提供慢病毒包装所需的蛋白质外壳部分.病毒外壳主要由gag，pol，env和rev蛋白所组成，它们大多来自水泡性口炎病毒包膜蛋白(vesicular stomatitis virus G-protein，VSV-G).在慢病毒载体构建过程中，首先使整合质粒、包装质粒和包膜质粒混合成三质粒混合体系，然后用该混合体系转染用于包装的细胞株，最后培养得到所需的慢病毒载体(见图1).

图1 慢病毒载体的形成过程

1.2 慢病毒载体的优势

利用慢病毒载体导入外源基因主要有以下优势[4-5]：第一，慢病毒载体感染对象广，可转染处于有丝分裂期和非有丝分裂期的细胞；第二，由慢病毒载体携带整合到宿主基因组的目的基因对转录后水平的基因沉默有一定的抵抗能力；第三，目的基因在慢病毒载体介导下均可在宿主细胞中实现持久稳定的表达；第四，第3代慢病毒载体中只保留了gag，pol和rev3个病毒基因[5]，且慢病毒载体具备自我失活的能力，作用过程中癌基因不会被激活，这保证了慢病毒载体的安全性[6].由于慢病毒载体具有如上众多的优势，使得慢病毒载体成为一种能实现外源基因的高效导入及应用于疾病的基因治疗等方面的具有良好应用前景的生物资源而得到广泛应用.

1.3 慢病毒载体的应用

1.3.1 基因治疗

1)HIV感染疾病治疗

目前使用的抗逆转录病毒的药物可较为有效地延长从感染病毒到出现艾滋病病症之间的间隔时间[7].虽然这种治疗方法在治疗前期可以取得良好的效果，但因其在治疗过程中不可避免地使艾滋病患者产生抗药性，使其在后期的治疗过程中难以取得理想的治疗效果[8].相比之下，采用慢病毒载体治疗HIV-1感染具有许多优势[9]：第一，慢病毒载体主要改造自HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)，可以与病毒RNA竞争包装蛋白和用于病毒复制的病毒蛋白，从而抑制病毒复制，控制HIV的感染；第二，慢病毒载体可以携带有抗HIV病毒的基因，特异地对病毒复制进行控制.

2)肿瘤疾病治疗

传统治疗肿瘤的方法多以手术切除、放疗、药物控制等为主，基因治疗的出现为肿瘤治疗提供了一种全新的思路.慢病毒载体可以安全有效地将治疗肿瘤基因植入人体内，并使其得以长期有效地表达.例如，在对神经胶质瘤的研究中，利用慢病毒载体向神经胶质瘤细胞中导入下调BCL2和TRAIL基因表达的shRNA，可激活细胞半胱氨酸3和半胱氨酸7的表达，从而加速神经胶质瘤细胞的凋亡[10].因此，可以利用慢病毒载体为肿瘤的治疗提供一种有效导入药物的手段.

1.3.2 研发新疫苗及新药物

流感病毒疫苗主要以流感病毒表面血凝素和神经氨酸酶为抗原制备.但由于流感病毒的高度变异性，因此给疫苗的制备带来了极大的困难.实验中，利用携带有流感病毒种属特异性基因的慢病毒载体转染特定的细胞株，从而获得大量病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)[11-13]，这为制备流感病毒疫苗提供了保证.此外，利用上述方法制备疫苗具有如下优点：第一，具有确切的种属特异性；第二，VLP为颗粒状，可以保证流感病毒蛋白具有最佳免疫原性；第三，可正确糖基化；第四，不含病毒蛋白；第五，可长时间收获；第六，生产周期短，通常只需几周的时间.

2 慢病毒载体介导的RNA干扰

2.1 RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA诱发的同源mRNA特异性降解现象，是生物进化中一项保守的防御机制.在细胞中，双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)被Dicer酶剪切成大小为21～26 bp的siRNA.之后，siRNA经解旋酶作用形成正义链和反义链，siRNA反义链再与细胞内的一些酶(解旋酶、内切酶、外切酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)；接着，在siRNA反义链指导下，RISC与其互补的转录产物结合，导致RNA发生特异性降解[14-17].

RNAi可导致目的基因的特异性沉默，从而可将其应用到基因敲除的实验中.因RNAi具有高稳定性、高特异性、高效性和可传播性等诸多优点，使得该技术在探索基因功能、抗病毒感染、基因治疗和抗肿瘤方面得到了广泛应用.

2.2 慢病毒载体介导的RNAi

慢病毒载体介导的RNAi是运用慢病毒载体将RNAi片段导入宿主细胞，从而抑制同源mRNA的表达.该方法将慢病毒载体的高感染性、高表达性与RNAi的特异性相结合.慢病毒载体介导的RNAi与其他方式介导的RNAi相比，具有可使目的基因产生持续而稳定沉默的显著优点.

慢病毒载体介导的RNAi主要有2种类型：一类分别转录生成正义链和反义链RNA，之后2条链互补生成siRNA；另一类则生成包含启动子、终止子和shRNA结构序列的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA).基于shRNA的慢病毒载体介导RNA干扰在实际操作过程中更为常见，其主要由shRNA表达框和慢病毒载体组成.携带外源基因的慢病毒载体将shRNA表达框整合进宿主基因组，进而被转录，形成2段碱基序列互补的核苷酸链配对结合，中间呈现茎环结构.之后，Dicer酶识别并切除茎环结构，产生能执行RNAi的siRNA(见图2).

图2 慢病毒载体介导的RNA干扰

2.3 慢病毒载体介导RNA干扰在基因治疗中的应用

2.3.1 抗病毒感染

病毒具有自我复制能力强、感染扩散速度快等特性，因此抗病毒治疗过程中应该采用稳定、高效、迅速的办法才能取得较好的治疗效果.在相关的研究中，对抗病毒感染主要从病毒的感染途径和作用机制两方面入手.在这些研究中，发现阻断病毒感染途径或抑制其疾病发生过程中关键蛋白的表达常可取得较为良好的效果.而正因为慢病毒载体介导的RNAi技术满足稳定、高效和迅速的要求，因此目前常被用来实现抗病毒感染的基因治疗.

HIV-1病毒在感染初期时，通过与DC特异性IGN受体(DC-SIGN)结合，然后侵入到CD4+ T淋巴细胞.之后，利用宿主细胞内的核苷酸、氨基酸等物质进行迅速复制，组装成大量新的病毒粒，然后释放到细胞间隙中，继续攻击宿主细胞周围的其他CD4+ T淋巴细胞，最终造成大量CD4+ T淋巴细胞死亡，机体免疫机能崩溃.在治疗HIV-1病毒感染过程中，HIV-1病毒与DC-SIGN受体的结合是病毒感染初期的关键步骤，若能抑制DC-SIGN受体的表达，就可以减弱病毒颗粒与它的结合，进而有效地抑制HIV-1的感染能力.慢病毒载体介导的针对DC-SIGN的RNAi，可显著抑制原代培养DC(dendritic cell)中DC-SIGN的表达.用HIV-1病毒感染该DC-SIGN表达被抑制的DC，发现HIV-1病毒与DC-SIGN的结合能力大大下降；再将上述HIV-1病毒颗粒感染后的DC与CD4+ T淋巴细胞一起培养，发现HIV-1感染CD4+ T淋巴细胞的效率明显降低[18].

2.3.2 癌症治疗

原癌基因的异常活动常会诱导癌症的发生.慢病毒载体能实现各类哺乳动物细胞中原癌基因的RNAi，抑制原癌基因的表达，从而降低癌变细胞的增殖和扩散能力，有效地延缓癌症的发生和治疗癌症.原癌基因BRAF的突变会引起黑色素瘤(malignant melanoma,MM)的发生.而MM细胞系的BRAF基因一般有2种表达方式：一种是野生型；另一种是突变型.后者的BRAF基因可以大量表达.利用慢病毒载体在MM细胞系中实现针对BRAF基因的RNAi，可以有效地抑制BRAF基因的表达，且降低MM BRAF突变型细胞系的增殖能力；相同处理过的野生型MM细胞系未表现出上述现象[19].运用慢病毒载体在肝脏肿瘤细胞中实现针对EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)的RNAi，可以使肿瘤细胞衰老和死亡.在小鼠乳腺癌细胞系4T1中，转录活化蛋白3(Signal transducer and activator of transcription,STAT3)常因原癌基因的激活而大量表达，并且磷酸化.如果将小鼠乳腺癌细胞系4T1注射到野生型小鼠乳腺中，小鼠将会发生乳腺癌.而用慢病毒载体介导实现针对4T1细胞系STAT3的RNAi，96 h后STAT3的表达和磷酸化几乎被完全抑制；之后,将该处理过的细胞系注射到野生型小鼠乳腺中，发现其几乎丧失了诱导小鼠乳腺癌的能力[20].人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)蛋白E6/E7在人类宫颈癌发生过程中起着极其关键的作用.研究者使用慢病毒载体介导，将针对E6/E7基因启动子和E6 mRNA的shRNA导入到2种宫颈癌细胞株Siha和Caski，结果发现,在2个细胞株内E6/E7蛋白的表达均受到了明显抑制，2个细胞株的增殖和入侵能力也大幅度下调[21-22].综上可以看出，使用慢病毒载体介导的RNAi技术可以特异性地沉默目的基因，并且有效地抑制了相关癌细胞的增殖和迁移，这提示我们将慢病毒载体介导的RNAi技术应用于临床治疗癌症具有很大的潜能[23-24].

2.3.3 遗传疾病治疗

慢病毒载体介导实现的RNA干扰技术为遗传疾病的基因治疗开辟了一条新思路，目前的许多研究试图从各类疾病的人源细胞模型和动物体细胞模型2个方面找到相应的应用点.超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)基因的突变常会导致遗传性肌肉萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS).利用发生SOD1基因点突变的转基因鼠作为遗传性ALS的一种动物模型.在该模型动物的椎管内注射介导针对突变型SOD1 RNAi的慢病毒载体，从而实现针对运动神经元细胞SOD1的RNAi.结果发现，突变型转基因鼠体内的SOD1表达量显著降低，ALS病症出现的时间延后，且发病速度也得到减缓[25].在人源细胞模型方面，常以镰刀型细胞贫血症(sickle cell anemia,SCA)患者的离体细胞作为模型.镰刀型细胞贫血症常由β珠蛋白基因突变引起.利用慢病毒载体实现针对β珠蛋白基因的RNAi，结果显示β珠蛋白的表达量明显降低[26-27].综合这两个方向的研究，可以推测，慢病毒载体为在患者体内实现针对致病基因的RNAi提供了可能，进而为疾病的治疗提供了一个新方向.

3 展 望

慢病毒具有感染能力强、导入基因持久稳定、外源基因表达量高等诸多优点，而且它既能感染体细胞，也能抑制各类疾病人源细胞中致病基因的表达，为高效稳定地实现病人体内特定基因的RNA干扰提供了可能性.利用慢病毒的特性，把它作为一种载体工具用于研究肿瘤的发病机制及基因治疗方法的开发，一方面提高了实验效率，另一方面也极大地节约了实验成本.利用慢病毒的特性实现对特定基因的沉默，为肿瘤相关疾病的基因治疗和新型基因药物的开发提供了实验依据和技术手段.

综上所述，慢病毒载体介导的RNAi技术具有高效、稳定、特异性强的特点，能在多种细胞中实现最佳的RNAi.因此，慢病毒载体在基因治疗领域具有广阔的应用前景，能为基因治疗提供有效的手段和有力的工具.

参考文献：

[1]Fan Junkai,Wei Na,Ding Miao,et al.Targeting Gene-Viro Therapy for prostate cancer by DD3-driven oncolytic virus-harboring interleukin-24 gene[J].International Journal of Cancer,2010,127(3):707-717.

[2]Cockrell A S,Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol,2007,36(3):184-204.

[3]McDonald C L,Benson J,Cornetta K,et al.Advancing translational research through the NHLBI gene therapy resource program (GTRP)[J].Human Gene Therapy Clinical Development,2013,24(1):5-10.

[4]Kiem H P,Jerome K R,Deeks S G,et al.Hematopoietic-stem-cell-based gene therapy for HIV disease[J].Cell Stem Cell,2012,10(2):137-147.

[5]Escors D,Breckpot K,Arce F,et al.Lentiviral vectors and gene therapy[M].New York:Springer,2012.

[6]Douglas J L,Lin W Y,Panis M L,et al.Efficient human immunodeficiency virus-based vector transduction of unstimulated human mobilized peripheral blood CD34+ cells in the SCID-hu Thy/Liv model of human T cell lymphopoiesis[J].Hum Gene Ther,2001,12(4):401-413.

[7]Morris K V,Rossi J J.Anti-HIV-1 gene expressing lentiviral vectors as an adjunctive therapy for HIV-1 infection[J].Current HIV Research,2004,2(2):185-191.

[8]Nischang M,Sutmuller R,Gers-Huber G,et al.Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection:a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1[J].PLoS One,2012,7(6):e38853.

[9]张薇,赵志英,张坤.慢病毒载体及应用研究进展[J].包头医学院学报,2011,27(5):107-109.

[10]Kock N,Kasmieh R,Weissleder R,et al.Tumor therapy mediated by lentiviral expression of shBcl-2 and S-TRAIL[J].Neoplasia,2007,9(5):435-442.

[11]Huret C,Desjardins D,Miyalou M,et al.Recombinant retrovirus-derived virus-like particle-based vaccines induce hepatitis C virus-specific cellular and neutralizing immune responses in mice[J].Vaccine,2013,31(11):1540-1547.

[12]McKay T,Patel M,Pickles R,et al.Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors[J].Gene Ther,2006,13(8):715-724.

[13]Haynes J R,Dokken L,Wiley J A,et al.Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge[J].Vaccine,2009,27(4):530-541.

[14]Stewart S A,Dykxhoorn D M,Palliser D,et al.Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells[J].RNA,2003,9(4):493-501.

[15]Maillard P V,Ciaudo C,Marchais A,et al.Antiviral RNA interference in mammalian cells[J].Science,2013,342(6155):235-238.

[16]Li Yang,Lu Jinfeng,Han Yanhong,et al.RNA interference functions as an antiviral immunity mechanism in mammals[J].Science,2013,342(6155):231-234.

[17]Chang S S,Zhang Zhenyu,Liu Yi.RNA interference pathways in fungi:mechanisms and functions[J].Annual review of microbiology,2012,66:305-323.

[18]Garcia-Vallejo J J,Koning N,Ambrosini M,et al.Glycodendrimers prevent HIV transmission via DC-SIGN on dendritic cells[J].International Immunology,2013,25(4):221-233.

[19]Sumimoto H,Miyagishi M,Miyoshi H,et al.Inhibition of growth and invasive ability of melanoma by inactivation of mutated BRAF with lentivirus-mediated RNA interference[J].Oncogene,2004,23(36):6031-6039.

[20]Ling Xiaoyang,Arlinghaus R B.Knockdown of STAT3 expression by RNA interference inhibits the induction of breast tumors in immunocompetent mice[J].Cancer Res,2005,65(7):2532-2536.

[21]Zhou Jiansong,Peng Chanjuan,Li Baohua,et al.Transcriptional gene silencing of HPV16 E6/E7 induces growth inhibition via apoptosis in vitro and in vivo[J].Gynecologic Oncology,2012,124(2):296-302.

[22]Zhou Jiansong,Li Baohua,Peng Chanjuan,et al.Inhibition of cervical cancer cell growth in vitro and in vivo by lentiviral-vector mediated shRNA targeting the common promoter of HPV16 E6 and E7 oncogenes[J].Antiviral Res,2013,98(2):305-313.

[23]Akhtar J,Wang Zhou,Zhang Zhiping,et al.Lentiviral-mediated RNA interference targeting stathmin1 gene in human gastric cancer cells inhibits proliferation in vitro and tumor growth in vivo[J].Journal of Translational Medicine,2013,11(1):212-220.

[24]Cao Dongxing,Li Zhijie,Jiang Xiaoou,et al.Osteopontin as potential biomarker and therapeutic target in gastric and liver cancers[J].World Journal of Gastroenterology,2012,18(30):3923-3930.

[25]Raoul C,Abbas-Terki T,Bensadoun J C,et al.Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS[J].Nature Medicine,2005,11(4):423-428.

[26]Hanna J,Wernig M,Markoulaki S,et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J].Science,2007,318(5858):1920-1923.

[27]Mansilla-Soto J,Rivière I,Sadelain M.Genetic strategies for the treatment of sickle cell anaemia[J].British Journal of Haematology,2011,154(6):715-727.