蔬菜中沙门氏菌生长特性的研究

,,,

(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

蔬菜中沙门氏菌生长特性的研究

冮洁,余鸿儒,武晓松,胡文忠

(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

以菠菜、香菜和樱桃番茄为实验材料,通过人工回接鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium),研究沙门氏菌在蔬菜上的生长特性。结果表明,沙门氏菌能够在上述3种蔬菜上侵染并大量繁殖。沙门氏菌在蔬菜上的生长情况受到温度和种类的影响,在25℃时,在樱桃番茄上的沙门氏菌生长量最大,为2.45×104cfu/g；而在4℃时,在香菜上生长的沙门氏菌量最大,菌数为7.5×103cfu/g。沙门氏菌的繁殖量随回接浓度增大而增大,但当回接浓度大于15cfu/g时,沙门氏菌生长会受到抑制。在回接菌后4～8h会出现一个沙门氏菌繁殖的高峰,随后在8～10h菌数明显下降,说明沙门氏菌一旦侵染蔬菜会在短时间内快速增长,12h后沙门氏菌繁殖量呈明显下降趋势,可能与致腐菌开始大量繁殖导致蔬菜失水、腐烂有关。

鼠伤寒沙门氏菌,香菜,樱桃番茄,菠菜,生长曲线

沙门氏菌(Salmonella)是一群寄生于人和动物肠道内的无芽孢革兰氏阴性直杆菌,其菌型繁多,分布广泛,是一种重要的引起食源感染性腹泻的致病微生物。在世界各地的食物中毒病例中,由沙门氏菌引起的位居前列,已严重威胁着消费者的身体健康,造成了巨大的经济损失[1-2]。在欧洲,每年有超过16万人感染沙门氏菌,发生率约为0.035%[3]。在美国,每年有超过140万人感染沙门氏菌,直接经济损失超过24亿美元[4]。在中国,每年由沙门氏菌造成的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40%～60%[5-6]。近年来,由于追求营养和口感,中式餐饮和西式餐饮中生食蔬菜消费品种、消耗量及消费人群均呈扩大和上升的趋势,安全问题也日趋受到关注[7]。然而当前人们对蔬菜卫生的要求主要着眼于蔬菜的农药残留、重金属的检测以及无公害蔬菜产地环境条件的规范,而对蔬菜的病原菌污染研究较少,至今没有新鲜蔬菜微生物的检测标准。蔬菜受病原菌污染可直接影响到广大消费者的健康,是消费者肠道传染病的重要媒介[8-9]。肉、蛋、奶等营养丰富动物性的食品是沙门氏菌主要传播媒介[10-14]。但对蔬菜的病原微生物监测中,也多次检测出沙门氏菌的存在。方敏等从武汉市胡萝卜样品中检出德尔卑沙门菌(Salmonelladerby)[15]。李秀桂等从南宁市生食蔬菜464份中检出11株沙门氏菌,阳性率为2.37%,其中香菜、香葱和生菜是受到污染主要品种；检出的沙门氏菌共分6个血清型,阿贡纳沙门氏菌是主要优势菌[16]。王清等人在四川省渠县蔬菜类食品绿豆芽中检出朗根萨尔查沙门氏菌[17]。黄志广等人从佛山市高明区农贸市场中的72个蔬菜样品中分离出2株沙门氏菌,检出率为2.78%[18]。并且,也有因为食用被沙门氏菌污染的蔬菜而引起食物中毒的事件发生。2008年6月,美国疾病控制和预防中心发出警告,沙门氏菌病疫情蔓延16个州,感染者达160余人,报告要求人们避免进食疑被沙门氏菌污染的一种红色圆形类西红柿,数千斤该种西红柿紧急下架。2009年8月,四川省凉山会东县发生疑似食物中毒事件,217人中毒1人死亡。据凉山州卫生局检测报告:1个凉拌菜样品中检出伤寒沙门氏菌。根据流行病学调查、临床表现和实验室检查结果认定此次事件是沙门氏菌污染食物引起的食物中毒事件。因此,对蔬菜污染沙门氏菌的检测和控制应引起人们的足够重视。本文选择菠菜、香菜和樱桃番茄作为样品,通过人工回接染沙门氏菌。观察不同温度下、不同浓度的沙门氏菌在蔬菜样品上的生长情况。为控制蔬菜中沙门氏菌的污染,避免食物中毒的发生提供参考。

1 材料和方法

1.1实验材料

菠菜、香菜、樱桃番茄 购自大连开发区大商新玛特超市；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium) 编号:GIM1.237,购自广东省微生物菌种保藏中心；蛋白胨,胰蛋白胨,酵母膏,亚硫酸铋(BS)琼脂培养基等 购自北京奥特星生物技术有限公司。

LB营养肉汤固体培养基(g/L) 胰蛋白胨10,酵母膏5,氯化钠10,琼脂20,pH7.2,121℃灭菌30min备用。

BS琼脂培养基(g/L) 蛋白胨10,牛肉膏5,葡萄糖5,亚硫酸钠6,磷酸氢二钠4,柠檬酸铋铵2,硫酸亚铁0.3,煌绿0.024,琼脂20。

1.2实验方法

1.2.1 蔬菜上沙门氏菌菌数的计数方法 蔬菜样品25g为一份,分别按0.15、1.5、15cfu/g的菌液浓度均匀涂在样品上,然后分别放在4(冷藏)、25(室温)、37℃(沙门氏菌最适生长温度)下保藏,前12h,每2h取一次样,12h后,每12h取一次样直至48h结束。

样品无菌条件下剪碎后放入225mL无菌水中,充分振荡摇匀后,取0.1mL样液在BS培养基上均匀涂布,37℃培养48h,记录菌落数。同时以不接沙门氏菌的蔬菜做为空白样品。

1.2.2 樱桃番茄表面菌数的计数方法 样品的准备和接菌按上述1.2.1相同方法操作,只是取25g样后不经剪碎,而是直接放入225mL无菌水中,充分振荡摇匀,洗掉樱桃番茄表面粘附的沙门氏菌后,取0.1mL液体在BS培养基上均匀涂布,37℃培养48h,记录菌落数。

1.3数据分析

每个实验处理3次重复,用Microsoft Excel软件计算平均值和标准偏差。

2 结果与讨论

2.1沙门氏菌在菠菜上的生长特性

由图1可见,菠菜在4℃保藏时,接种量为0.15cfu/g和1.5cfu/g的样品,前4h沙门氏菌菌数逐渐增大,而接种量为15cfu/g的样品,前6h沙门氏菌在菠菜上菌数逐渐增大,随后菌数都逐渐减少。接种浓度为1.5cfu/g,在4h时菌数达最大,为4.6×103cfu/g。从图2可见,菠菜在25℃保藏时,前6h沙门氏菌在菠菜上菌数逐渐增大,接种浓度为1.5cfu/g,在6h时菌数达最大,为2.03×104cfu/g,比在4℃保藏时的最大菌数增加4.41倍。在4℃保藏时,沙门氏菌依然能够生长,但生长速度较慢,在25℃时,生长速度加快。回接浓度影响沙门氏菌的繁殖,由于蔬菜中可供沙门氏菌利用的营养成分的限制,并不是回接菌数越大,沙门氏菌繁殖量越大。由于在37℃保藏时,菠菜腐烂情况严重,因此没有研究在37℃时沙门氏菌在菠菜上的生长特性。

2.2沙门氏菌在香菜上的生长特性

从图3中可以看出,香菜在4℃保藏时,接种量为0.15cfu/g和1.5cfu/g的样品,前4h沙门氏菌菌数逐渐增大,而接种量为15cfu/g的样品,沙门氏菌在前6h生长速度较快,在6h达到最大菌数为7.5×103cfu/g。而在25℃保藏时(图4),沙门氏菌的生长速度更加加快,接种量为0.15cfu/g和1.5cfu/g的样品,前4h沙门氏菌菌数逐渐增大,而接种量为15cfu/g的样品,前8h菌数逐渐增加；接种量为0.15cfu/g时,在4h时,最大菌数可达1.64×104cfu/g(25℃),比4℃保藏时,相同接种浓度、相同时间情况下,菌数增加3.49倍。香菜和菠菜等绿叶蔬菜,在37℃保藏时,腐烂情况严重,因此没有研究在37℃时沙门氏菌在香菜上的生长特性。

图3 沙门氏菌在香菜上的生长曲线(4℃)Fig.3 The growth curve of Salmonella in parsley(4℃)

图4 沙门氏菌在香菜上的生长曲线(25℃) Fig.4 The growth curve of Salmonella in parsley(25℃)

2.3沙门氏菌在樱桃番茄上的生长特性

从图5中可以看出,沙门氏菌在樱桃番茄中的生长情况,在4℃保藏时,接种量为0.15cfu/g和1.5cfu/g的样品,前4h沙门氏菌菌数逐渐增大,而接种量为15cfu/g的样品,沙门氏菌在前6h生长速度较快,接种量是0.15cfu/g和1.5cfu/g时,在4h时,菌数就达到最大值,分别为3.8×103cfu/g和5.2×103cfu/g;当接种量是15cfu/g时,在6h达到最大菌数为3.0×103cfu/g。而在25℃保藏时(图6),接种量为1.5cfu/g和15cfu/g的样品,前4h沙门氏菌菌数逐渐增大,而接种量为0.15cfu/g的样品,在前6h菌数逐渐增大。接种量为1.5cfu/g,在4h时,最大菌数可达2.45×104cfu/g(25℃),比同样的接种量,在4℃时,同样时间,菌数增加4.71倍。

图5 沙门氏菌在樱桃番茄上的生长曲线(4℃)Fig.5 The growth curve of Salmonella in cherry tomatoes(4℃)

图6 沙门氏菌在樱桃番茄上的生长曲线(25℃)Fig.6 The growth curve of Salmonella in cherry tomatoes(25℃)

对沙门氏菌在樱桃番茄上的生长情况,除了在上述4℃和25℃保藏外,由于樱桃番茄在37℃时腐烂情况较轻,还研究了在37℃时沙门氏菌生长情况(图7)。37℃是沙门氏菌最适宜生长温度。因此,研究了沙门氏菌在37℃时在樱桃番茄内部和表面生长情况(图8)。从图7中可以看出,取样后樱桃番茄没有剪碎,只计数樱桃番茄表面的沙门氏菌数时,接种浓度为0.15cfu/g,在4h时,最大菌数为5.5×103cfu/g。而从图8中可见,取样后将樱桃番茄剪碎,计算表面和内部的沙门氏菌,接种浓度同样为0.15cfu/g,在4h时,最大菌数达9.8×103cfu/g,比樱桃番茄表面的沙门氏菌数增加1.78倍,说明沙门氏菌可以侵入到樱桃番茄内部,且在樱桃番茄内部生长繁殖。

图7 沙门氏菌在樱桃番茄表面的生长曲线(37℃)Fig.7 The growth curve of Salmonella on cherry tomatoes surface(37℃)

图8 沙门氏菌在樱桃番茄内部和表面生长曲线(37℃)Fig.8 The growth curve of Salmonella in internal and surface of cherry tomatoes(37℃)

3 结论

沙门氏菌在上述菠菜、香菜和樱桃番茄等3种蔬菜上侵染后能够大量繁殖。沙门氏菌在蔬菜上的生长情况受到温度的影响,常温(25℃)条件下3种蔬菜污染的最大菌数可达104cfu/g,冷藏(4℃)条件下蔬菜污染的最大菌数为103cfu/g,说明常温条件更适合沙门氏菌的繁殖,因此,蔬菜运输和保藏应选在低温条件下。相同温度下,各蔬菜的污染最大菌数有一定差异。4℃条件下,香菜的污染菌数最大,而25℃条件下樱桃番茄的污染菌数最大。沙门氏菌在蔬菜上的生长情况也受到回接菌浓度的影响,一定浓度下沙门氏菌的繁殖量随回接浓度增大而增大,但当回接浓度大于15cfu/g时,沙门氏菌生长会受到抑制,生长速度和繁殖量下降。在回接4～8h会出现一个沙门氏菌繁殖量的高峰,随后明显下降,说明沙门氏菌一旦侵染蔬菜会在短时间内快速增长。因此对于蔬菜来说,沙门氏菌的防控应在采摘后及时进行,以避免接触沙门氏菌污染源后沙门氏菌在蔬菜上迅速繁殖。通过对樱桃番茄样品剪碎处理和未剪碎处理实验的对比可知,沙门氏菌可以侵入到樱桃番茄内部,且在樱桃番茄内部生长繁殖。12h后沙门氏菌繁殖量呈明显下降趋势,可能与致腐菌开始大量繁殖导致蔬菜失水、腐烂有关。

[1]马兆飞,李洁莉,胡红琴,等.PCR和实时PCR技术快速检测牛奶样品中的沙门氏菌[J].中国食品学报,2008,8(5):132-137.

[2]杜雄伟,李叶,冮洁,等.肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].食品工业科技,2013,34(12):68-70.

[3]Mc Guinness S,McCabe e,O’Regan E,etal. Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection ofSalmonellaon fresh meat[J]. Meat Sci,2009,83(3):555-562.

[4]Hong Y,Berrang M E,Liu T,etal. Rapid detection of CampylobactercoliC.jejuni,andSalmonellaentericaon poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(6):3492-3499.

[5]滕要辉,索标,艾志录,等.速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用[J].食品科学,2013,34(8):140-144.

[6]童哲,程苏云,梅玲玲. 浙江省272份食品沙门氏菌检测结果[J]. 浙江预防医学,2003,15(4):33-34.

[7]高铭营,李宝聚,石延霞,等.鲜食蔬菜中食源性病原菌污染及防控[J].中国食物与营养,2009,5:9-11.

[8]Neal J A,Marquez-Gonzalez M,Cabrera-Diaz E,etal. Comparison of multiple chemical sanitizers for reducingSalmonellaandEscherichiacoliO157∶H7 on spinach leaves[J]. Food Research International,2012,45:1123-1128.

[9]秦田秀. 桂林市2008-2011 年市售食品中食源性致病菌调查[J]. 中国热带医学,2013,13(4):444-446.

[10]徐桂云,樊世杰.家禽沙门氏菌感染现状及不同国家的防治策略[J].中国家禽,2012,34(9):7-12.

[11]刘喆,张书萧,王少辉,等.沙门氏菌的检测技术进展[J].中国动物传染病学报,2012,20(2):81-86.

[12]Sy K V,Murray M B,Harrison M D,etal. Evaluation of gaseous chlorine dioxide as a sanitizer for killingSalmonella,EscherichiacoliO157∶H7,Listeriamonocytogenesand yeasts and molds on fresh and fresh-cut produce[J]. Journal of Food Protection,2005,68(6):1176-1187.

[13]Ukuku D O,Bari M,Kawamoto S,etal. Use of hydrogen peroxide in combination with nisin,sodium lactate and citric acid for reducing transfer of bacterial pathogens from whole melon surfaces to fresh-cut pieces[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,104(2):225-233.

[14]刘仲敏,郑鸣,王永芬,等.食源性沙门氏菌实时定量PCR检测研究[J]. 食品工业科技,2007,28(8):233-236.

[15]方敏,郑华英,郭爱玲,等.自市售生食蔬菜胡萝卜中检出沙门菌报告[J].中国卫生检验杂志,2006,16(12):1537.

[16]李秀桂,黄彦,唐振柱,等.南宁市生食蔬菜中病原菌污染监测[J]. 应用预防医学,2008,14(6):361-363.

[17]王清,王小林,郑国顺,等.在蔬菜类食品中检出朗根萨尔查沙门氏菌分析[J].中国保健营养,2013,1:40-41.

[18]黄志广,莫嘉延,李凤贞.佛山市高明区农贸市场中食源性沙门氏菌血清型与耐药性现状[J]. 公共卫生与预防医学,2012,23(6):6-9.

Research onSalmonellagrowthcharacteristics in vegetables

GANGJie,YUHong-ru,WUXiao-song,HUWen-zhong

(College of Life Sciences,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)

Using spinach,coriander and cherry tomato as material,through artificial inoculationSalmonellatyphimurium,the growth characteristics ofSalmonellain vegetables were studied. The results showed thatSalmonellacould infect and bloom the above three kinds of vegetables.Salmonellagrowth in the vegetables were influenced by temperature and species. The maximum number ofSalmonellagrowth at 25℃ reached 2.45×104cfu/g in cherry tomato,and that at 4℃reached 7.5×103cfu/g in parsley.Salmonellagrowth in vegetables also were affected by the concentration of artificial inoculation. Under certain circumstances,the more artificial inoculation concentration,the more concentration ofSalmonellagrew. However,when the artificial inoculation concentration was higher than 15cfu/g,Salmonellagrowth would be inhibited. After inoculation,salmonellabred to reach a peak in 4～8h,decreased significantly in 8～10h,indicating thatSalmonellaonce infected vegetables would rapidly grow in a short time. After 12h,Salmonellareproductive output was significantly decreased,while the bacteria begin to multiply rapidly in vegetables,resulting in their water loss and decay.

Salmonellatyphimurium; parsley;cherry tomato;spinach;growth curve

2013-12-02

冮洁(1965-),女,博士,教授,研究方向为食品生物技术。

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2012BAD38B05)。

TS255.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001