红芪与黄芪中两个异黄酮类成分含量的比较研究△

李成义，王燕，强正泽，李硕

(甘肃中医学院 药学院，甘肃 兰州 730000)

红芪与黄芪中两个异黄酮类成分含量的比较研究△

李成义，王燕，强正泽，李硕*

(甘肃中医学院 药学院，甘肃 兰州 730000)

目的通过高效液相色谱法，对红芪和黄芪药材进行鉴别和定量分析，为药材质量评价提供科学依据。方法色谱柱为TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TC-C18保护柱(10 mm× 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.01%磷酸水溶液(梯度洗脱)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为248 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。结果15批红芪样品中芒柄花素的质量分数均高于毛蕊异黄酮，其中芒柄花素质量分数在77.51～424.94 μg·g-1，毛蕊异黄酮质量分数在2.27～26.13 μg·g-1；而7批黄芪中芒柄花素的质量分数均低于毛蕊异黄酮，其中芒柄花素质量分数在4.84～29.94 μg·g-1，毛蕊异黄酮质量分数在12.95～62.98 μg·g-1。结论毛蕊异黄酮和芒柄花素的相对质量分数可作为红芪与黄芪的定性鉴别和质量评价的主要特征之一。

红芪；黄芪；毛蕊异黄酮；芒柄花素；HPLC

红芪(Hedysari Radix)与黄芪(Astragali Radix)均为甘肃主产特色药材，其分别来源于豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.、蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。在中医临床上，红芪与黄芪均为补气要药，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌的功能，多用于治疗气虚引起的各种病症[2-3]。中药红芪自古与黄芪通用，临床用药时红黄不分，直到1985年版《中国药典》始将两者分列。药材的传统鉴别虽简单易行，但其应用范围相对较窄，且需积累大量的鉴别经验。而高效液相色谱法作为常用的一种现代鉴别方法，其应用范围较广。通过HPLC法不仅可对红芪和黄芪药材进行定性鉴别，还可对其所含指标性成分进行定量分析，进而对药材质量作出初步判断。

1 材料与仪器

1.1 材料

实验所用22批药材样品分别采自甘肃省定西市和陇南市的不同乡镇。经甘肃中医学院药学院李成义教授鉴定，1～15号样品为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，16～22号样品为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

对照品毛蕊异黄酮(批号：MUST-13030602)和芒柄花素(批号：MUST-13050801)购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均为99%；乙腈(天津市光复精细化工研究所，色谱纯)；甲醇(天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯)；磷酸(天津市凯信化学工业有限公司，优级纯)；水(娃哈哈纯净水)。

1.2 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(安捷伦公司)，DAD检测器(美国)；万分之一AL 104型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；十万分之一OHAUS Corporation DV SERIES型电子天平(奥豪斯仪器有限责任公司)；DJ-02型中药粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)；HHS-4S型电热恒温水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；KQ-250TDB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TC-C18保护柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(B)-0.01%磷酸水(A)溶液，梯度洗脱(0～25 min，30%～33% B；25～45 min，33%～36% B)，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为248 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。在此色谱条件下色谱图分离度良好(见图1)。

A.红芪药材 B.黄芪药材 C.对照品 1.毛蕊异黄酮 2.芒柄花素 图1 红芪、黄芪药材及对照品HPLC图

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液的配制 分别精密称取毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品1.13 mg、4.05 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容于10 mL容量瓶中，作为贮备液A、B。分别精密吸取这两种对照品贮备液2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合对照品溶液C。

2.2.2 供试品溶液的配制 精密称取药材样品粉末3.000 0 g，置150 mL锥形瓶中，加入甲醇30 mL，于80 ℃水浴回流提取1 h，过滤，滤液减压回收甲醇至一定量后再以适量甲醇定容至10 mL容量瓶中，进样前以0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液[4]。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取一定量的混合对照品溶液，将其制成8个系列浓度的混合对照品溶液，其中毛蕊异黄酮质量浓度为0.226，0.452，2.260，11.300，22.600，33.900，45.200，61.020 μg·mL-1，芒柄花素质量浓度为0.810，1.620，8.100，40.500，81.000，121.500，162.000，218.700 μg·mL-1，进样10 μL，测定。以质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及其线性范围，见表1。

表1 毛蕊异黄酮、芒柄花素成分的线性回归方程

2.4 精密度试验

精密吸取2.2.1项下所制毛蕊异黄酮和芒柄花素的混合对照品溶液，连续进样6次，按2.1项下色谱条件测定峰面积，其峰面积积分值的RSD值分别为0.05%、0.04%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一批红芪药材的供试品溶液(编号：2013-SY-03)，于室温下放置，分别于0，4，8，12，20，24 h 进样检测，按2种异黄酮类成分的峰面积积分值分别计算其RSD值。结果该样品中毛蕊异黄酮、芒柄花素的RSD值分别为2.65%、0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一批红芪药材粉末(编号：2013-SY-03)，精密称取样品6份，按2.2.2项下方法制成6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别测定。结果该样品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的RSD值分别为1.50%、0.76%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称定已知毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的红芪样品(编号：2013-SY-03)9份，每份约1.0 g，精密加入一定量的毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品，其加入量分别为该样品中相应成分含量的80%(10.17，222.75 μg)、100%(14.69，263.25 μg)、120%(18.08，303.75 μg)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定。结果毛蕊异黄酮和芒柄花素回收率的RSD值分别为2.76%、2.52%。

2.8 红芪与黄芪样品中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量测定

22批样品的供试品溶液均按2.2.2项下方法制备，按2.1项下所述色谱条件进行测定，分别记录毛蕊异黄酮和芒柄花素相应色谱峰的峰面积，然后将色谱峰峰面积代入相应的回归方程，计算红芪与黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的质量分数，结果见表2。

表2 红芪、黄芪药材中毛蕊异黄酮、芒柄花素的测定

2.9 红芪中毛蕊异黄酮与芒柄花素含量的线性关系分析[6]

毛蕊异黄酮与芒柄花素为红芪药材中两个主要的异黄酮类成分，通过SPSS 17.0软件对15批样本的相关系数(r=0.663)进行显著性检验，P<0.01，说明红芪药材中毛蕊异黄酮质量分数与芒柄花素质量分数之间存在线性关系。在线性拟合时以毛蕊异黄酮为自变量，芒柄花素为因变量，应用最小二乘法可得表2中所有红芪样品数据的拟合图(见图2)及一元线性回归方程：Y=48.412+9.478X。通过对该回归方程的F检验，P<0.01，说明此回归方程有意义。

图2 红芪中毛蕊异黄酮与芒柄花素质量分数关系拟合图

3 讨论

从表2可以看出15批红芪样品中芒柄花素的质量分数均高于毛蕊异黄酮，其中芒柄花素质量分数在77.51～424.94 μg·g-1，毛蕊异黄酮质量分数在2.27～26.13 μg·g-1；而7批黄芪中芒柄花素的质量分数均低于毛蕊异黄酮，其中芒柄花素质量分数在4.84～29.94 μg·g-1，毛蕊异黄酮质量分数在12.95～62.98 μg·g-1。此特点可作为红芪与黄芪鉴别及质量评价的主要特征之一。

通过实验数据分析，表明本实验所采用的测定红芪与黄芪药材中2个化合物含量的鉴别方法简便、可靠、准确，且具有一定的实用性，可用于红芪与黄芪的定性定量鉴别。

通过对样本红芪中毛蕊异黄酮与芒柄花素含量的线性关系分析，证明红芪中毛蕊异黄酮含量与芒柄花素含量之间存在线性关系。该线性关系的建立可在仅知道某一种成分含量的情况下对另一种成分的含量进行初步估算。

毛蕊异黄酮和芒柄花素为红芪与黄芪药材中的指标成分，均具有抗肿瘤、抗氧化、保护内皮细胞、防止骨质疏松及神经保护等作用。近年来，有学者对红芪和黄芪中两个异黄酮类成分与药效的相关性及两成分药效间的差异性进行了初步研究，发现芒柄花素是广泛存在于自然界的一种具有类雌二醇分子结构的化合物，具有弱雌激素样作用，可促进乳腺发育，保护心血管系统，改善血脂紊乱，降低总胆固醇，抑制肠平滑肌收缩及促进伤口愈合等作用[6-8]；

毛蕊异黄酮具有防止肾脏纤维化[9]和保护脑细胞[10]等作用；同时还发现毛蕊异黄酮保护神经元细胞能力和抗氧化能力强于芒柄花素[11-12]。但目前有关中药红芪与黄芪中芒柄花素和毛蕊异黄酮的药效与药材质量相关性研究的报道尚不多见，有待进一步研究。

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ComparativeStudyofFormononetinandCalycosinContentinHedysariRadixandAstragaliRadix

LIChengyi，WANGYan，QIANGZhengze，LIShuo*

(GansuCollegeofTraditionalChineseMedicine，Lanzhou730000,China)

Objective：To do identification and qualitative analysis on Hedysari Radix and Astragali Radix by HPLC，and provide a scientific basis for the quality evaluation.MethodsThe sample was separated on TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.01%phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wave length was set at 248 nm.The column temperature was set at 30 ℃.The injection volume was 10 μL.ResultsFormononetin content was higher than calycosin in Hedysari Radix.Formononetin content was between 77.51～424.94 μg·g-1，and calycosin between 2.27～26.13 μg·g-1，but the contents in Astragali Radix were exactly opposite.Formononetin content was between 4.84～29.94 μg·g-1，and calycosin between 12.95～62.98 μg·g-1.ConclusionThe relative content of formononetin and calycosin can be main features of qualitative identification and quality evaluation on Hedysari Radix and Astragali Radix.

Hedysari Radix；Astragali Radix；Calycosin；Formononetin；HPLC

国家自然科学基金委员会资助项目(地区科学基金项目)——甘肃地产药材红芪道地性与生态因子的相关性研究(81360621)

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李硕，讲师，研究方向：中药品种与质量研究；Tel：(0931)8765385，E-mail：29068323@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.004

2014-05-04)