多巴胺受体2减轻离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤

李鸿珠，高 君，郝晓敏，张丽敏，陈俊亭

(1.哈尔滨医科大学 基础医学院 病理生理学系专业， 黑龙江 哈尔滨 150086； 2.哈尔滨市第一医院 骨三科，黑龙江 哈尔滨 150010； 3.哈尔滨医科大学 基础医学院 机能实验中心， 黑龙江 哈尔滨 150086；4.哈尔滨医科大学 附属第四医学院 麻醉科， 黑龙江 哈尔滨 150001)

研究论文

多巴胺受体2减轻离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤

李鸿珠1*，高 君2，郝晓敏3，张丽敏3，陈俊亭4

(1.哈尔滨医科大学 基础医学院 病理生理学系专业， 黑龙江 哈尔滨 150086； 2.哈尔滨市第一医院 骨三科，黑龙江 哈尔滨 150010； 3.哈尔滨医科大学 基础医学院 机能实验中心， 黑龙江 哈尔滨 150086；4.哈尔滨医科大学 附属第四医学院 麻醉科， 黑龙江 哈尔滨 150001)

目的观察多巴胺受体2(DR2)对离体大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的影响及其可能机制。方法将大鼠40只，每组n=10，随机分成对照组(control)、I/R组、10 μmol/L Bromocriptine(DR2激动剂)组(Bro)，10 μmol/L Haloperidol (DR2抑制剂)组(Hal)。用Langendorff离体灌流装置，复制大鼠心肌I/R损伤模型。Powerlab生理记录仪记录心功能；比色法测定冠脉流出液LDH、CK活性和心肌组织匀浆SOD活性以及MDA含量；TUNEL染色检测心肌细胞凋亡；Western blot检测DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白的表达。结果与对照组比较，I/R组DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表达、LDH和CK活性、MDA含量和细胞凋亡率均增加(Plt;0.01)，唯有SOD活性降低，心功能减弱(Plt;0.01)。与I/R组比较，Bro降低LDH和CK活性、MDA含量、细胞凋亡率、caspase- 3和caspase- 9的表达，升高SOD活性，改善心功能和进一步增加Bcl- 2的表达(Plt;0.01)；Hal对上述指标影响不显著。结论DR2可减轻心肌I/R损伤，其机制与抗氧化、清除自由基、上调Bcl- 2表达以及下调caspase- 3和caspase- 9的表达有关。

多巴胺受体2；缺血/再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠；心肌

缺血性心脏病的死亡率占所有器官之首。揭示心肌缺血/再灌注损伤的发生机制和研发有效的保护药物，已成为国内外的关注热点。

多巴胺受体属于G蛋白偶联受体，有5种亚型：D1、D2、D3、D4 和D5，根据其药理作用和结构特征将其分为D1和D2两个家族，D1和D5受体属于D1受体家族，D2、D3和D4受体属于D2受体家族[1]。一直以来对多巴胺受体的研究，主要集中在帕杰森病、精神分裂症、药物成瘾等神经精神系统疾病上[2- 3]。已有报道，从脑组织克隆出的所有DR在外周均存在[2- 3]。本实验前期研究发现，在大鼠心肌缺血/再灌注损伤过程中，DR2表达增加[3]，并且其激活通过抑制线粒体、死亡受体途径及MAPK通路减轻乳鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤[4- 5]。但是，DR2激活对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响及机制尚未见报道。本研究观察DR2激活对心肌缺血/再灌注损伤的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级Wistar大鼠，体质量0.25～0.3 kg，雌雄不拘，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(合格证号：SCXK(黑)2013- 001)。

1.2 主要试剂

Bromocriptine(Bro)和Haloperidol(Hal)(Sigma-Aldrich公司)，Western 及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)，DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TUNEL 凋亡检测试剂盒(Roche试剂公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mg/kg)及肝素(1 000 IU/kg体质量)。麻醉后迅速取出心脏，通过主动脉逆行插管连接在Langendorff离体灌流装置上，以80 mmH2O的压力Krebs-Henseleit磷酸缓冲液灌流大鼠心脏，灌流过程中用95% O2和5% CO2混合气体平衡灌流液。

1.3.2 实验分组：40只大鼠，随机分为4组，每组n=10。1)对照组：心脏正常灌流180 min；2)I/R组：心脏先预灌注平衡20 min，停止灌流40 min之后再复灌120 min；3)Bro组：方法同I/R组，只是在复灌时加入10 μmol/L Bro；4)Hal组：方法同I/R组，只是在复灌时加入10 μmol/L Hal。

1.3.3 生化指标检测：心肌再灌注后，留取冠脉流出液，测定LDH和CK的活性。将心肌用组织匀浆器研磨并制成10%组织匀浆，按照试剂盒说明书检测 SOD 活性和 MDA 含量。

1.3.4 TUNEL染色检测细胞凋亡：取心室肌切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，然后固定、脱水、浸蜡、包埋，制成厚度为10 μm的切片，光镜下观察细胞凋亡情况。正常心肌细胞核染成蓝色，凋亡的细胞核呈棕褐色，数不少于500个心肌细胞核，凋亡率计算：AI(%)=(凋亡细胞数/500)×100%

1.3.5 心功能测定：用Powerlab生理记录系统记录各项心功能指标：左室末端舒张压(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)，左室发展压(left ventricular developed pressure, LVDP)以及左室内压最大上升(下降)速率(positive and negative maximum rate of left ventricular pressure development,±dp/dtmax)。

1.3.6 Western blot检测DR2、Bcl- 2、caspase- 3和caspase- 9蛋白表达：取心肌组织加入蛋白裂解液，冰浴40 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液进行蛋白质定量。取50 μg蛋白样品于10% SDS-PAGE凝胶电泳；随后转印于PVDF滤膜上，用5% 脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h；用封闭液稀释一抗，4 ℃振荡过夜；TBST稀释二抗，室温振荡孵育2 h；最后显色，计算条带吸光度值，蛋白表达水平以其与GAPDH吸光度比值来表示。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 DR2蛋白表达变化

与对照组比较，I/R组DR2蛋白表达明显增加(Plt;0.01)(图1)。

*Plt;0.01 compared with control group图1 DR2蛋白表达Fig 1 DR2 protein expressions

2.2 LDH、CK、SOD活性和MDA含量的变化

与对照组比较，I/R明显增加LDH、CK活性和MDA含量，而降低SOD活性(Plt;0.01)；与I/R组比较，Bro显著降低LDH、CK活性及MDA含量，升高SOD活性(Plt;0.01)(表1)。

表1 LDH、CK和SOD活性及MDA含量变化

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

2.3 各组心功能变化

与对照组比较，I/R组心功能明显减弱(Plt;0.01)；与I/R组比较，Bro显著改善心功能(Plt;0.01)(表2)。

2.4 心肌细胞凋亡率的变化

与对照组比较，I/R组细胞凋亡率明显增加(Plt;0.01)；与I/R组比较，Bro组细胞凋亡率明显减少(Plt;0.01)(图2)。

表2 心功能各个指标的改变Table 2 The changes of cardiac fuction(±s, n=10)

*Plt;0.01 compared with control group;#Plt;0.01 compared with I/R group.

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group图2 心肌细胞凋亡率的变化Fig 2 The changes of the apoptosis rate ofcardiomyocytes(×400)

2.5 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表达变化

与对照组相比，I/R增加caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表达 (Plt;0.01)；与I/R组比较，Bro降低caspase- 3和caspase- 9的表达，增加Bcl- 2的表达 (Plt;0.01)(图3)。

3 讨论

目前认为，心肌I/R损伤的机制与心肌能量代谢障碍、氧自由基大量产生、细胞内钙离子超载、血管内皮细胞分泌一系列内皮因子等因素有关[6]。

*Plt;0.01 compared with control group; #Plt;0.01 compared with I/R group图3 Caspase- 3、caspase- 9和Bcl- 2蛋白表达变化Fig 3 The changes of caspase- 3, caspase- 9 and Bcl- 2 protein expressions

氧自由基的大量产生，可使心肌组织脂质过氧化物增多，MDA含量增加，进而导致细胞膜结构改变，使心肌细胞受损[3]。dp/dtmax、LVSP、LVEDP 等指标，可反映心肌功能的情况[7]。本研究显示，I/R增加DR2蛋白表达，且I/R组LDH和CK漏出及MDA含量均增加，SOD活性降低，心功能减弱；而Bro则减少LDH和CK漏出及MDA含量，升高SOD活性，改善心功能。说明DR2激活可减轻心肌I/R损伤，其机制与清除自由基和减少脂质过氧化有关。

心肌I/R损伤可导致细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡中发挥着重要的作用。I/R可引起线粒体通透性转换孔(mPTP)开放导致线粒体内释放细胞色素C(Cyt c)、Smac/DIABLO和AIF等线粒体凋亡因子，引起细胞凋亡[4]。Cyt c释放到细胞质后，可激活caspase- 9，后者进一步激活 caspase- 3 导致细胞凋亡。Bcl- 2 通过抑制Cyt c的释放和 caspase 激活发挥抗凋亡作用[4]。

本结果显示，I/R组细胞凋亡率、caspase-3、caspase-9和Bcl- 2 蛋白表达均增加，而Bro降低细胞凋亡率，抑制 caspase- 3 和 caspase- 9 的表达，促进 Bcl- 2 的表达。说明DR2 激活可通过下调 caspase- 3 和 caspase- 9 的表达，上调 Bcl- 2 的表达发挥抗细胞凋亡作用。I/R时Bcl- 2表达增加，可能是机体的一种代偿性适应性反应。

综上所述，DR2激活可减轻I/R对心肌细胞的损伤，其机制与抗氧化、上调Bcl-2表达及下调caspase- 3/- 9的表达有关。激活心肌DR2有望为缺血性心脏病的防治提供一个新思路和新靶点。

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[5] 高君，魏璨，陈爱东，等. 2 类多巴胺受体激活对细胞凋亡的影响及与 MAPK 通路的关系[J]. 中华临床医师杂志，2013, 7:4878- 4882.

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DR2 attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury of rats in vitro

LI Hong-zhu1*, GAO Jun2, HAO Xiao-min3, ZHANG Li-min3, CHEN Jun-ting4

(1.Dept. of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086; 2.the First Hospital of Harbin, Harbin 150010; 3.Experiment Center, Harbin Medical University, Harbin 150086; 4.Dept. of Anesthesiology, the Fourth Affiliated Hospital ofHarbin Medical University, Harbin 150001, China)

ObjectiveTo observe the effects of dopamine receptors-2 (DR2) on the myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats and to study the possible mechanisms.Methods40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups (n=10): control group, I/R group, Bromocriptine group (Bro) and Haloperidol group (Hal). Myocardial ischemia/reperfusion injury of isolated rats was induced by Langendorff system; The heart function was recored by Powerlab; LDH, CK activities of coronary effluent and SOD activity and MDA content of myocardial tissue homogenate were measured by colorimetric method; Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL staining; The expression of DR2, Bcl- 2, caspase- 3 and caspase- 9 was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the expressions of DR2, Bcl- 2, caspase- 3, caspase- 9, the activity of LDH and CK, the MDA content, the rate of cell apoptosis were increased (Plt;0.01), but the SOD activity and heart function were decreased in the I/R group (Plt;0.01). Compared with I/R group, Bro decreased the activity of LDH and CK, the MDA content,

the rate of cell apoptosis, the expression of caspase- 3 and caspase- 9, increased the SOD activity and Bcl- 2 expressions, improved heart function (Plt;0.01). Hal did not change the above indexes.ConclusionsDR2 inhibites I/R injury through antioxidation that is poteintially explained by scavenging free radical, up-regulation of Bcl- 2 expressions and down-regulation of caspase- 3 and caspase- 9 expression.

dopamin receptors- 2; ischemia/reperfusion injury; apoptosis; rats; myocardium

2014- 03- 17

2014- 05- 27

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531348)

*通信作者(correspondingauthor)：hongzhuli61@163.com

1001-6325(2014)10-1372-04

R 542.2

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