脂联素减轻高糖诱导的人血管内皮细胞系损伤

李 熠，匡双玉，尹 凯，匡稳定，桂庆军*

(南华大学 医学院 1.诊断学教研室；2.附属第二医院， 湖南 衡阳 421001)

研究论文

脂联素减轻高糖诱导的人血管内皮细胞系损伤

李 熠1，匡双玉2，尹 凯1，匡稳定2，桂庆军1*

(南华大学 医学院 1.诊断学教研室；2.附属第二医院， 湖南 衡阳 421001)

目的观察脂联素(APN)对高糖诱导血管内皮细胞系损伤的保护作用及NF-κB与LOX- 1蛋白表达在其中的作用。方法30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12(人脐静脉内皮细胞系)，不同浓度的脂联素(10、20和40 μg/mL)作用48 h及20 μg/mL 脂联素作用不同时间(12、24、48和72 h)后，倒置相差显微镜观察内皮细胞形态，Western blot检测核转录因子NF-κB和LOX- 1蛋白表达, 间接免疫荧光法检测NF-κB核转位情况。结果脂联素作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12，内皮细胞形态改善，折光性增强，胞内颗粒物减少，细胞排列相对规整；同时，LOX- 1蛋白表达下调(Plt;0.05)，NF-κB活性降低(Plt;0.05)，并呈现时间和浓度依赖性(n=3,Plt;0.05)。结论脂联素可能通过NF-κB信号通路引起LOX- 1蛋白表达下调，从而发挥其对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用。

D-葡萄糖；人脐静脉内皮细胞；脂联素；LOX- 1；NF-κB

脂联素(Adiponectin，APN)是一种由脂肪细胞分泌的血浆蛋白，通过抑制炎性反应、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化及抑制血管新生等[1- 5]发挥其心血管保护作用，但具体机制尚不清楚。本实验在高糖诱导血管内皮细胞系损伤的模型上，观察APN对高糖诱导血管内皮细胞的保护作用及NF-κB、LOX- 1蛋白表达在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

脂联素(Ramp;D公司)；RMPI- 1640培养基和胰蛋白酶(Hyelone公司)；新生胎牛血清(杭州四季清公司)；BCA 蛋白定量试剂盒和Western印迹荧光检测试剂盒(Hyclone. Pierce公司)；LOX- 1和NF-κB一抗(Santa Cruz公司)；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2人脐静脉内皮细胞系(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC-12)的培养

HUVEC- 12(ATCC公司)。HUVEC- 12培养在10%(体积分数)加热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，培养液中加青霉素和链霉素各1.0×105IU/L，培养条件为5%(体积分数)CO2，37 ℃，饱和湿度，0.125%的胰蛋白酶传代,待细胞长至70%～80%汇合的时候进行试验。倒置相差显微镜下观察，细胞为鹅卵石样。

1.3 HUVEC- 12的形态学观察

使用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。

1.4Westernblot检测HUVEC-12中NF-κB和LOX-1蛋白质的表达水平

收集不同条件处理的HUVEC- 12细胞，三去污裂解液裂解细胞，5 000 r/min离心去除沉淀，BCA试剂测定蛋白含量，上样缓冲液调各组蛋白浓度使各组一致，经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳2 h(积层胶80 V，分离胶120 V)后电转移(4 ℃，100 mA，3 h)至PDVF膜上，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白分子质量标准的位置。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，按1∶1 000加入兔抗鼠SREBP- 1一抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗3次，1∶2 000加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗3次后，用Western blot荧光检测试剂盒显影、定影。结果重复3次。用图象分析仪分析目的蛋白/内参照吸光度比值。

1.5间接免疫荧光检测HUVEC-12细胞NF-κB核转位

取对数生长期细胞，以4×104/孔接种于24孔培养板，在37 ℃、5% CO2条件下培养过夜后，按分组要求给以不同处理因素。处理终结，用预冷的PBS洗涤3次，每孔加固定液(甲醇∶冰乙酸 3∶1)200 μL，在4 ℃条件下固定15 min，再用预冷的PBS洗涤3次，加穿透液(0.25%聚乙二醇辛基苯基醚+5%二甲基亚砜混合液)1 mL，37 ℃放置45 min，再用预冷的PBS洗涤3次，加入一抗(1∶200)200 μL，37 ℃孵育1 h，预冷的PBS洗涤3次，加入罗丹明和绿色荧光(FITC)标记的二抗(1∶10)50 μL，37 ℃孵育1 h，荧光倒置显微镜下观察并照相。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 D-葡萄糖诱导HUVEC- 12的形态学变化

不同浓度的D-葡萄糖(15、30和60 mmol/L)作用于HUVEC- 12 48 h及30 mmol/L D-葡萄糖作用于HUVEC- 12不同时间(12、24、48及72 h)后，对照组内皮细胞生长状态良好，细胞之间紧密连接，呈多角形或扁平形，折光性强，而不同剂量和不同作用时间的高糖诱导组的HUVEC- 12折光性变弱，排列较为紊乱，细胞系模糊，细胞间隙明显增大，细胞内颗粒状物增多。以30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12 48 h的内皮细胞形态变化最明显(图1)。

2.2APN干预下的D-葡萄糖诱导的HUVEC-12细胞形态学变化

不同浓度APN(10、20和40 μg/mL)作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12 48 h及20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12不同时间(12、24、48 和72 h)后，与对照组相比，诱导组内皮细胞收缩，变圆，胞体变小，胞内颗粒明显增多，而APN干预组相比诱导组其内皮细胞形态改善较明显，折光性增强，胞内颗粒减少。排列相对规整。以20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12 48 h形态变化最显著(图2)。

A.control; B.model图1 D-葡萄糖诱导HUVEC- 12细胞形态改变Fig 1 The morphology changes of HUVEC- 12 cells induced by D-glucose(×400)

A.control; B.model; C.APN图2 APN干预下的D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12形态改变Fig 2 The morphology changes of D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(×400)

2.3APN对D-葡萄糖诱导的HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表达的影响

不同浓度APN(10、20及40 μg/mL)作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12 48 h后，NF-κB及LOX- 1蛋白表达下调，其中20 μg/mL APN使NF-κB及LOX- 1蛋白表达下调最明显 (图3)。

2.4APN干预下D-葡萄糖诱导HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表达的时效变化

20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12不同时间(12、24、48和72 h)后，在APN不同时间的干预下，D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12中NF-κB及LOX- 1蛋白表达均下调，其中作用48 h后的内皮细胞NF-κB及LOX- 1蛋白表达下调最明显(图4)。

2.5APN对D-葡萄糖诱导的HUVEC-12中NF-κB核转位的影响

20 μg/mL脂联素作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12 48 h后，正常对照组内皮细胞组中， P65绿色荧光信号信号主要定位于胞质，胞核少见或未见(图5)。

1.model；2.10 μg/mL；3.20 μg/mL；4.40 μg/mL; *Plt;0.05 compared with model group图3 APN干预下D-葡萄糖诱导HUVEC- 12细胞中LOX- 1蛋白表达量效关系Fig 3 LOX- 1 protein expression with a dose-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

1.model; 2.12 hours; 3.24 hours; 4.48 hours; 5.72 hours; *Plt;0.05 compared with model group图4 APN干预下D-葡萄糖诱导HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表达时效关系Fig 4 LOX- 1 protein expression with a time-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

A.control; B.model; C.APN图5 不同作用下的HUVEC- 12中 NF-кB-P65蛋白的核转位荧光图Fig 5 Different fluorescent nuclear translocation of NF-кB-P65 in HUVEC-12 cells(×400)

3 讨论

APN是由脂肪细胞特异性分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质, 目前认为其是一种胰岛素抵抗和动脉粥样硬化的保护因子[6- 7]。本实验通过不同浓度脂联素作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC- 12不同时间，观察内皮细胞形态及检测细胞内LOX- 1表达。发现随APN浓度的增加和作用时间的延长，HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表达均下调，受损细胞形态得到了一定程度的改善；证实了APN可以通过下调高糖诱导的HUVEC- 12中LOX- 1的表达，从而发挥其保护血管内皮的功能。

文献报道，LOX- 1在介导内皮损伤中发挥重要作用[8]。调控LOX- 1蛋白表达的机制众多，炎性因子，氧化应激产物以及机械刺激等可诱导其表达。大鼠LOX- 1基因启动子区域含有多个顺式作用元件，如NF-κB，表明LOX- 1的表达可能受NF-κB激活的调控[9]。本实验发现不同浓度的APN作用高糖诱导组内HUVEC- 12不同时间，在受损的内皮细胞内NF-κB-P65表达下调的同时，其对应的内皮细胞内LOX- 1表达水平也下调，表明LOX- 1蛋白的表达下调与APN作用于受损内皮细胞引起的NF-κB蛋白表达水平下调存在一定关系。

为了进一步说明APN可以通过NF-κB途径调控LOX- 1表达，本实验用免疫荧光观察使用了APN后，APN可抑制受损内皮细胞内的NF-κB向胞核内迁移，阻碍其启动靶基因的转录，减少LOX- 1蛋白的表达。其机制可能与APN与细胞系内特定的靶基因结合，启动了IκB等抑制亚单位的表达或者抑制了IκB的快速磷酸化和降解，减少了NF-κB活化[10]。

本实验以体外培养的HUVEC- 12为研究对象，观察了APN对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用，同时研究了在此过程中细胞内NF-κB与LOX- 1蛋白的表达，为进一步阐明糖尿病动脉粥样硬化早期的发病机制提供了一定的实验依据。

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Adiponectin alleviates hyperglycemia induced vascular endothelial cells injury

LI Yi1, KUANG Shuang-yu2, YIN Kai1, KUANG Wen-ding2, GUI Qing-jun1*

(1.Medical College, University of South China; 2.the Second Affiliated Hospital,University of South China， Hengyang 421001， China)

ObjectiveTo observe the protective effect of adiponectin (APN) on hyperglycemia-induced vascular endothelial cell injury,and to investigate the expresstion of NF-κB and LOX- 1 in the role of the protection process.MethodsD-Glucose of 30 mmol/L effect on HUVEC- 12 for 48 hours to create a hyperglicemia-model of injured vascular endothelial cells, Incubate the cells with different concentration adiponectin(10,20,40 μg/mL) for 48 hours and adiponectin of 20 μg/mL for different time(12,24,48,72 h)and then to observe the morphologic changes of the endothelial cells and the expression of NF-κB and LOX- 1 protein in the HUVEC- 12 was detected by Western blot, and NF-κB nuclear translocation in cells was observed by indirect immunofluorescence.ResultsD-Glucose-induced HUVEC- 12 were effected by adiponectin with different density and time, The morphologic changes of the cells converted to ameliorate: the reflected light of the HUVEC- 12 was strengthened, particulate matter in cells was not clear and the cell shape converted from roundness to flat or polygon, NF-κB and LOX- 1 protein expression were down-regulated partly with a dose and time-dependence(n=3,Plt;0.05).ConclusionsAdiponectin (APN) may down-regulate LOX- 1 protein expression through NF-kB signaling pathway so the protective effect on D-Glucose-induced HUVEC- 12.

D-Glucose; HUVEC- 12; Adiponectin; LOX- 1; NF-κB

2013- 03- 25

2014- 04- 18

2013年湖南省教育厅优秀青年科研项目(2013B098)

*通信作者(correspondingauthor)：zd81412@163.com

1001-6325(2014)10-1386-05

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