贲门腺癌组织中RKIP、E-cadherin的表达变化及相关性

魏 红，齐淑静，刘文利，徐 亮，李丽东，李 华，董稚明，郭 炜，瞿 峰

(1河北工程大学附属医院，石家庄050011;2邯郸市第四医院;3河北省肿瘤研究所)

贲门腺癌是我国北方最常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查发现，高发区贲门腺癌的发病率和病死率有逐年上升的趋势。在肿瘤病因学研究中，人们发现Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)具有抑制肿瘤细胞转移的作用。同时发现上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)在肿瘤细胞凋亡中起作用，但两者在贲门腺癌中表达及相关性尚无报道。我们检测了贲门腺癌中RKIP、E-cadherin表达变化，并探讨其相关性，为进一步治疗贲门腺癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008～2013年在河北工程大学附属医院手术治疗的经病理证实的160例贲门腺癌患者为研究对象，其中男112例、女48例，年龄37～83(61.8±8.7)岁，其中 ＜60岁66例、≥60岁94例。按UICC和AJCC标准进行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期70例、Ⅲ～Ⅳ期90例。按照肿瘤的病理分期进行分级，高分化41例、中等分化54例、低分化65例，所有患者术前未做放化疗。

1.2 试剂 RKIP兔多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，兔SP免疫组化检测试剂盒、DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PBS缓冲液购自天津市标准科技有限公司，枸橼酸修复液购自天津市博迪化工有限公司。

1.3 RKIP和E-cadherin检测方法 手术取癌原发灶及癌旁非肿瘤组织(距癌组织2～5 cm)，用10%中性甲醛固定标本，脱水包埋，切片，厚度3～4 μm，烤片过夜，脱蜡，高压热修复抗原，加一抗，37℃孵育，加二抗，孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。应用免疫组织化学SP法检测RKIP和E-cadherin，用已知阳性切片做RKIP和E-cadherin阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。RKIP判断标准为阳性染色定位于细胞质，以胞质出现均匀棕黄色颗粒定义为阳性细胞。参照Fromowitz评分标准，随即选取5个高倍视野(×400)计数肿瘤细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率，当贲门腺癌组织中存在不同分化程度的区域时，选择同一肿瘤组织切片中占优势分化程度的肿瘤区域进行计数统计，阳性细胞率≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分;再按多数阳性细胞呈现的染色强度予以计分:无显色为0分、浅棕黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。将上述两项得分相加:0分判为“-”、1～2分判为“+”、3～4分判为“++”、5～6分判为“+++”。以“++”和“+++”为RKIP蛋白阳性表达，“-”和“+”为阴性表达。由3名有经验的临床病理医师阅片，根据其评分的平均值确定判定结果。E-cadherin表达定位于细胞膜及细胞质，以细胞膜及细胞质出现黄褐色或淡黄色颗粒为阳性表达，参照纪小尤等提供的免疫组织化学阳性判断标准，每张切片阳性细胞数≤10%或无阳性着色为阴性，阳性细胞数＞10%为阳性。随机选择10个高倍镜视野(HE×400)，连续计数至少1 000个肿瘤细胞。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，两个变量间的关系采用Spearman秩相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 贲门腺癌及癌旁组织中RKIP、E-cadherin的表达 RKIP和E-cadherin在贲门腺癌组织中的表达率分别为 38.75%(62/160)和 70.62%(113/160)，而在癌旁非肿瘤组织中的表达率分别为52.50%(84/160)和81.25%(130/160)，RKIP 和 E-cadherin在贲门腺癌组织中的表达率低于癌旁非肿瘤组织中的表达率(P均＜0.05)。

2.2 贲门腺癌组织中RKIP、E-cadherin的表达及其与临床病理参数的关系 不同性别、年龄的贲门腺癌组织中RKIP和E-cadherin的阳性表达率差异无统计学意义(P均＞0.05)。不同临床分期的贲门腺癌组织中RKIP的阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05)，但E-cadherin的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.01)。不同癌组织分化程度及有无淋巴结转移的RKIP和E-cadherin阳性表达率间差异均有统计学意义(P均＜0.05)。见表1。

表1 贲门腺癌组织中RKIP和E-cadherin表达与临床病理参数的关系(例)

2.3 贲门腺癌组织中RKIP、E-cadherin表达的相关性 贲门腺癌组织中RKIP表达阴性98例，其中E-cadherin表达阴性15例、阳性83例;贲门腺癌组织中RKIP表达阳性62例，其中E-cadherin表达阴性32例、阳性30例。RKIP和E-cadherin在贲门腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.388，P ＜0.01)。

3 讨论

Raf是磷脂酞乙醇胺结合蛋白家族的成员，是高度保守、广泛表达的小分子胞质蛋白［1］。Yeung等［2］首次发现 RKIP，随后有研究［3，4］发现 RKIP 不仅可以干扰Raf-1/MEK/ERK信号通路，而且还可以抑制NF-κB和G蛋白偶联受体激酶等信号传导过程。2003年Fu等［5］发现人C4-2B转移性前列腺癌细胞系明显减低，并且在小鼠中RKIP的表达增加与原发肿瘤血管浸润的减少和抑制原发肿瘤的生长有联系。2005年Keller等［6］研究进一步证明，在良性前列腺组织中RKIP表达水平最高，而随着Gleason评分的增加，前列腺癌组织中RKIP表达水平逐渐减低，在转移的前列腺癌组织中RKIP的mRNA水平和蛋白水平均低于非转移的前列腺癌细胞，提示RKIP功能的丧失与前列腺癌的转移呈正相关。在结直肠癌的研究［7，8］中亦出现相似结论:在有淋巴结转移的结直肠癌中RKIP低表达，同时RKIP的表达和肿瘤复发和生存率呈负相关。本实验中RKIP在贲门腺癌组织中比癌旁组织表达明显降低，RKIP在有淋巴结转移的贲门腺癌组织中比无淋巴结转移的组织中表达明显降低，且RKIP的表达与年龄、性别及临床分期无关，与之前研究结果基本一致。

研究表明，E-cadherin是钙黏蛋白家族的重要成员之一，它由723～748个氨基酸组成，其末端位于细胞外，对Ca2+有高度敏感性，而羧基末端位于细胞内，与肌动蛋白相连，由此形成深层蛋白与细胞骨架肌支蛋白相连的黏附层，对于维持细胞形态和调节细胞黏附具有重要作用。当E-cadherin结构和功能发生异常时，其黏附作用降低，细胞容易从原发病灶脱离并逃离而发生侵袭、转移［9］。E-cadherin能够抑制肿瘤细胞脱离原发灶，是重要的肿瘤转移抑制基因之一［10］。本研究中，E-cadherin在贲门腺癌组织中比癌旁组织表达明显降低，并随着临床分期的加深和分化程度的降低其表达明显降低，在有淋巴结转移的贲门腺癌组织中比无淋巴结转移的组织中表达明显降低，提示E-cadherin的异常表达可能与贲门癌的分化、侵袭和转移有关。

RKIP和E-cadherin在肿瘤侵袭、转移中的作用已在乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌等肿瘤中被证实，但两者在贲门腺癌中的相关性研究尚未见报道。陆身修等［11］发现前列腺癌病例中RKIP表达与E-cadherin的表达呈正相关。本研究通过对160例贲门腺癌中RIKP和E-cadherin表达相关性分析发现:RKIP与E-cadherin的表达呈正相关，说明贲门腺癌组织中RIKP表达下降，E-cadherin表达也下降，使细胞间黏附作用减弱，肿瘤细胞容易脱落，从而增强其转移能力。RKIP与E-cadherin正相关性机制可能是:RKIP通过干扰Raf-1/MEK/ERK信号通路，促进锌指因子对E-cadherin的抑制;RKIP可能通过抑制 Raf，影响TGF-β信号通路［12，13］，使Raf和TGF-β信号的协同作用加强，导致E-cadherin的表达下调;基因甲基化致转录抑制，锌指因子与E-cadherin，近端启动子上的E-box结合，抑制其表达。

综上所述，RKIP与E-cadherin均是肿瘤转移抑制因子，在贲门腺癌组织中表达降低，表达的降低能促进贲门腺癌的淋巴转移并增加其恶性程度，通过联合检测有助于临床早期对贲门腺癌淋巴结转移进行干预治疗，还可以作为贲门腺癌转移的标志物，对贲门腺癌发展及预后判断具有重要意义。

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