艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件优化及其纯化＊

陈 伟，刘文恩，李艳华，简子娟，罗 姗，钟一鸣（中南大学湘雅医院检验科，长沙 410008）

艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，是院内肠道感染的主要致病菌之一［1-2］。近年来，艰难梭菌感染性疾病发病率，尤其是毒素阳性患者检出率有所升高，此类患者的病情通常较为严重，患者病死率较高［3-7］。目前，可用于艰难梭菌检测的方法较多，相对常见是酶联免疫吸附法进行毒素检测［8-9］。相关研究报道显示，艰难梭菌毒素B可单独致病［10-11］。因此，如果临床仅单纯进行艰难梭菌毒素A的检测，有可能漏检部分患者。目前，国内外均已出现了多药耐药艰难梭菌感染病例［12］，而疫苗免疫是防治艰难梭菌感染的最理想途径和方法［13-16］。相关研究表明，抗艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3抗体可作为免疫疫苗，保护完整细胞免受毒素B的细胞毒性作用［17］。

本研究前期通过提取艰难梭菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）扩增了毒素B受体结合区CDB3基因片段，成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-CDB3，该载体经异丙基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）诱导后可表达融合蛋白，且所表达的融合蛋白经Western blot试验验证正确［18］。然而，由于制备单克隆抗体需要大量且纯化的抗原用于小鼠免疫及杂交瘤细胞筛选。因此，本研究拟通过优化融合蛋白诱导表达条件，大量表达融合蛋白，并对其进行纯化，为抗艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3单克隆抗体的研制奠定基础，为艰难梭菌的检测与疾病的预防提供新方法。

1 材料与方法

1.1 实验菌株实验菌株为本实验室刘元元硕士构建并于-80℃保存的含融合质粒pGEX-4T-1-CDB3的大肠埃希菌（E.coli）菌株BL21（DE3），此质粒具有氨苄西林（Amp）抗性和谷胱甘肽转移酶（GST）纯化标签［19］。

1.2 仪器与试剂酶标检测仪（美国BIO-TEK公司）、恒温摇床（天呈实验仪器制造有限公司）、-80℃超低温冰箱（中科美菱公司）、微型双垂直电泳仪（沃德生物医学仪器公司）；十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶配制试剂盒（上海碧云天有限公司）、IPTG（北京鼎国生物技术有限公司）、Amp（上海生工生物工程有限公司）、SefinoseTMGST亲和层析柱（上海生工生物工程有限公司）、抗GST单克隆抗体（德国MERCK公司）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司）、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物有限公司）、医用X光胶片（美国柯达公司）等。

1.3 方法

1.3.1 融合蛋白诱导表达条件优化 从-80℃冰箱取出鉴定正确的含融合质粒pGEX-4T-1-CDB3的E.coli BL21（DE3）菌种，接种于含100μg／mL Amp的LB固体培养基中，过夜培养，挑选单个菌落接种于3mL含100μg／mL Amp的LB液体培养基中，37℃、200r／min摇菌过夜；次日按1∶50的比例取过夜菌液加入含100μg／mL Amp的LB液体培养基中，37℃，300r／min摇菌；以诱导前菌液浓度［以600nm波长下的光密度值（OD600）表示，即0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0］、诱导温度（15、25、30、37、42℃）、诱导剂IPTG浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol／L）和诱导时间（2、4、6、8、10、12、16、18h）为单变量，分别诱导融合蛋白的表达，并取1 mL菌液用于后续检测。在此基础上，本实验设计了4因素3水平正交试验以进一步优化融合蛋白的诱导表达条件，试验设计因素及水平见表1。根据《分子克隆实验指南（第3版）》中描述的SDS-PAGE标准操作步骤进行蛋白质电泳［19］，然后对PAGE胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白条带。

表1 正交试验因素水平

1.3.2 融合蛋白表达形式的检测 以最佳诱导条件诱导融合蛋白表达，收集菌液，4℃、6 000×g离心10min，弃上清液，留沉淀，按原体积1／10的比例加入细菌裂解缓冲液Ⅱ、苯甲基磺酰氟（PMSF，终浓度0.1mmol／L）、溶菌酶（终浓度8g／L），充分混匀，冰上缓慢振摇30min，加入脱氧胆酸钠（终浓度8g／L）混匀并继续振摇20min，冰上超声裂解至液体不黏稠；4℃、12 000×g离心10min，分别收集上清（可溶性蛋白）及沉淀（包涵体），SDS-PAGE分析融合蛋白表达形式。

1.3.3 融合蛋白的Western blot鉴定 按照前述方法进行SDS-PAGE，然后根据融合蛋白大小，切取适当位置的SDSPAGE胶，从负极向正极依次放3层滤纸（面积略小于PVDF膜）、PVDF膜、胶和3层滤纸（面积略小于PVDF膜），电流稳定100mA，转膜3.5h；37℃、5%脱脂奶封闭2h，抗GST单克隆抗体（1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀释）4℃孵育过夜，1×磷酸盐缓冲液与吐温20混合液（PBST）洗涤3次，HRP标记羊抗小鼠IgG抗体（1∶1 000稀释）37℃孵育1h，1×PBST洗涤3次，避光条件下加入发光液发光，显影并定影。

1.3.4 融合蛋白的纯化、透析、浓缩及保存 按最佳诱导条件扩大培养菌液后诱导融合蛋白表达，按上述方法收集可溶性蛋白，按SefinoseTM GST亲和层析柱说明书进行蛋白纯化，以SDS-PAGE验证纯化效果，以Western blot验证纯化蛋白，并将融合蛋白进行透析、浓缩，加入甘油（终浓度50%）后-20℃保存。

2 结 果

2.1 融合蛋白最佳诱导条件分析以诱导前菌液OD600、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间为单变量，分别对含融合质粒pGEX-4T-1-CDB3的E.coli BL21（DE3）培养菌液进行诱导，结果显示，融合蛋白诱导表达受诱导前菌液OD600的影响较小，受IPTG浓度、诱导温度和诱导时间的影响较大，在OD600 0.8、IPTG 0.6mmol／L、诱导时间12h、温度30℃条件下，融合蛋白的表达量相对较高，见图1～4。经正交试验优化，最终确定融合蛋白的最佳诱导条件为诱导前菌液OD600为0.8、IPTG浓度为0.6mmol／L、诱导时间为12h及诱导温度为30℃，见图5。

2.2融合蛋白表达形式分析SDS-PAGE分析结果显示，融合蛋白主要以可溶性蛋白为主，其表达量约占总表达量的2／3，见图6。

图1 不同的诱导前菌液浓度对融合蛋白表达的影响

图2 不同的IPTG浓度（mmol／L）对融合蛋白表达的影响

2.3 融合蛋白的Western blot鉴定利用融合蛋白中的GST标签进行Western blot验证，结果显示融合蛋白相对分子质量为100×103左右及GST标签蛋白相对分子质量为26×103左右，与SDS-PAGE分析结果一致；当抗GST单克隆抗体稀释倍数为1∶500时，条带最为明显，表明诱导蛋白为目的融合蛋白，见图7。

图3 不同诱导时间对融合蛋白表达的影响

图4 不同诱导温度对融合蛋白表达的影响

图5 正交试验SDS-PAGE

图6 融合蛋白表达形式分析

图7 融合蛋白Western blot分析结果

2.4 纯化融合蛋白的分析Western blot分析结果显示，成功纯化了融合蛋白，其纯度超过90%，见图8。

图8 纯化融合蛋白Western blot鉴定结果

3 讨 论

乳糖操纵子是一种可诱导负调控型操纵子，已被广泛应用于E.coli工程菌株的构建。E.coli BL21为蛋白酶缺陷型菌株，受T7Lac启动子调控，IPTG诱导剂是其表达的必要条件。IPTG为乳糖结构类似物，是一种常用的高效乳糖启动子诱导剂，可与阻遏蛋白结合形成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，导致阻遏蛋白与O序列解离而不能结合到Lac启动子上，从而使乳糖操纵子能够转录、诱导蛋白的表达。IPTG诱导条件简单，可以直接进入E.coli细胞内部发挥诱导作用，且IPTG作为一种非代谢性的诱导物，不被代谢和降解，效果持久稳定，因此，只需极少量就能稳定地诱导乳糖启动子的转录。

优化E.coli工程菌株诱导培养条件的目的在于提高融合蛋白的产量，降低成本。诱导过程中影响融合蛋白表达的因素较多，除菌株自身因素和表达质粒的质量外，还包括多种外界条件，例如诱导前菌液OD600、IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等。细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此，必须对诱导前菌液浓度进行控制。IPTG浓度对表达水平的影响也较大。本实验在0.1～2.0mmol／L范围内进行IPTG浓度调节，以寻找最佳的使用浓度。诱导温度亦可影响E.coli中外源蛋白的表达水平，一般采用15～42℃。诱导时间过长、生长过度可加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体，即变性蛋白。综合以上因素，本实验利用IPTG作为诱导物，诱导融合蛋白的表达，并对每个影响因素设置不同梯度进行反复摸索，最终通过正交试验寻找诱导融合蛋白表达的最佳条件，从而使融合蛋白获得高水平表达。

本实验设计了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0共计8个诱导前菌液OD600水平，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol／L共计7个IPTG诱导浓度水平；2、4、6、8、10、12、16、18 h共计8个诱导时间水平，以及15、20、30、37、42℃共计5个诱导温度水平。研究发现，诱导前菌液OD600、IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度对融合蛋白的表达水平都有一定影响，但诱导前菌液OD600的影响相对较小。在OD600为0.4～0.8时，融合蛋白表达量仅有小幅上升，在OD600为0.8时表达量最高，可能是由于OD600低于0.8时，细菌总数少，因而蛋白表达量低。然而，当OD600高于0.8时，细菌已处于过度生长状态，不再处于对数生长期，细菌活力下降，死菌数目增加，目的蛋白表达量随之减少，而杂蛋白表达量增加。融合蛋白的表达受诱导时间的影响较大，但并非诱导时间越长融合蛋白表达量越多。本实验发现，在诱导时间为12h时，融合蛋白的表达水平较高，诱导时间超过12h时，其表达量的变化不明显，且时间越长，越有利于包涵体的形成。因此，本研究选择诱导时间为12h。IPTG浓度对融合蛋白的表达水平影响较大，但并非IPTG浓度越大融合蛋白表达量越多。本实验发现，当IPTG浓度超过0.6mmol／L时，融合蛋白的表达量上升不明显。此外，由于IPTG本身具有毒性，价格也很昂贵，且IPTG浓度过高时，诱导蛋白的表达速度过快，不利于可溶性蛋白的形成。因此，本研究选择IPTG诱导浓度为0.6mmol／L。诱导温度不仅影响菌体的生长，同时也影响重组质粒的稳定性和融合蛋白的表达水平。30℃适合菌液的生长，也适合可溶性融合蛋白的表达，此时融合蛋白的表达量最大。在此基础上，本研究设计了4因素3水平正交试验以优化设计，最终确定诱导前菌液OD600 0.8、诱导时间12h、IPTG诱导浓度0.6mmol／L、诱导温度30℃为最佳诱导条件。在此诱导条件下，在相对分子质量为100×103左右处出现明显条带，略大于融合蛋白的预期大小（相对分子质量为97.7×103），可能与蛋白本身携带电荷，导致电泳条带有一定的迁移有关。

Western blot验证结果显示，本研究诱导表达的蛋白可与抗GST单克隆抗体结合，因此，可以认为该融合蛋白即为艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白，并且于相对分子质量为26×103附近也出现弱条带，即为GST标签蛋白。经表达产物定位分析，发现艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白以可溶性蛋白表达为主，其原因可能是本研究采用低诱导剂浓度及低诱导温度，使融合蛋白表达时间延长，有利于其正确折叠，也有可能是由于本研究采用带GST标签的载体，而GST蛋白可溶性较高，可增加融合蛋白的可溶性。经SefinoseTMGST亲和层析柱纯化后，融合蛋白的纯度可超过90%，经验证确定为艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白，可用作单克隆抗体制备中的小鼠免疫抗原及杂交瘤细胞筛选蛋白。

本研究成功优化了艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白的诱导表达条件，并获得了高水平表达的融合蛋白，且以可溶性蛋白表达为主。本研究成果为后续单克隆抗体的制备奠定了基础。

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