淋巴结RUNX3基因甲基化与胃癌临床病理因素的关系研究

杨国祥，杜寒松，张万里，金 鑫，张 娟（.长江航运总医院普外科，武汉 43000；.华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉 4300；3.湖北省襄阳市中心医院肿瘤科 440）

RUNX3通过调控细胞的凋亡而抑制正常细胞癌变，其mRNA及蛋白质在胃癌组织中呈低表达状态，且其表达水平与病理类型及临床分期密切相关，可作为胃癌诊断、病情及预后评估的标志物［1-2］。但这些研究均限于手术切除后肿瘤标本的检测，而对手术切除标本淋巴结RUNX3甲基化与临床病理因素的关系研究较少［3］。本研究采用甲基化特异性PCR（MSP）检测胃癌患者手术切除淋巴结RUNX3基因启动子甲基化状态，以探讨RUNX3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2010年1月至2013年1月长江航运总医院手术治疗的60例胃癌患者为研究对象，其中男36例，女24例；年龄30～75岁，平均（56.2±11.9）岁；幽门螺旋杆菌（HP）感染阳性21例，阴性39例。入选标准：（1）经体格检查、影像学检查、胃镜活检和（或）术后病理组织学检查确诊为胃癌患者；（2）初治患者，术前未接受放疗或化疗。所有患者取经病理组织学检查证实为胃癌转移的淋巴结，保存于液氮中，用于RUNX3基因甲基化检测。

1.2 方法根据DNA提取试剂盒说明提取胃癌患者淋巴结基因组总DNA。采用MSP法检测RUNX3基因启动子甲基化状态。引物采用Methprimer（http：／／www.urogene.org／cgi-bin／methprimer／methprimer.cgi）设计，序列见表1，PCR扩增体系为25μL，循环条件为：95℃预变性10min，95℃变性1 min，65℃退火35s，72℃延伸35s，共30个循环，最后一轮72℃延伸10min。MSP产物经琼脂糖凝胶电泳后显影检测。

表1 RUNX3基因启动子甲基化MSP引物序列

1.3 统计学处理采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，计数资料进行χ2检验或Fisher精确概率法计算P值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

60例胃癌患者中淋巴结RUNX3基因启动子甲基化40例，甲基化率为66.7%。RUNX3基因启动子甲基化率在性别、年龄、吸烟史、酗酒史、家族史、HP感染和肿瘤部位中的差异无统计学意义（均P＞0.05）；在Lauren′s分型、组织学分级、肿瘤最大径、远处转移、TNM分期和手术方式中的差异有统计学意义（P＜0.05）。弥漫型、G3～G4、肿瘤最大径大于或等于5cm、有远处转移、TNM分期晚和姑息手术患者淋巴结RUNX3基因启动子甲基化率显著高于肠型、G1～G2、肿瘤最大径小于5cm、无远处转移、TNM分期早和根治手术患者（P＜0.05），具体结果见表2。

表2 胃癌患者RUNX3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系

续表2 胃癌患者RUNX3基因启动子甲基化与临床病理因素的关系

3 讨 论

RUNX3通过调控TGF-β通路抑制正常细胞癌变，在肿瘤的发病机制、诊断、病情和预后评估中具有重要作用。研究表明，导致RUNX3表达下降的机制包括基因突变及表观遗传学修饰。表观遗传学是不依赖于DNA序列改变的转录前调控方法，其中甲基化是表观遗传学最重要的调控机制，在越来越多的肿瘤中被发现呈高甲基化状态，可作为肿瘤诊断、病情及预后评估的生物标志物，其灵敏度及特异性普遍高于目前传统的标志物［4］。研究表明，RUNX3在胃癌组织中的表达低于正常组织。Osaki等［5］采用AS251多抗检测胃癌细胞RUNX3蛋白质表达，发现6种胃癌细胞株中RUNX3蛋白质均呈低表达状态。陈晓宇等［6］检测RUNX3蛋白在胃癌组织中的表达，其阳性表达率低于其在癌旁组织，同时低分化胃癌组织中的阳性表达率低于高、中分化胃癌组织，认为RUNX3蛋白表达降低与胃癌分化程度有密切关系。基于基因表达法则，目前认为RUNX3基因缺失或甲基化修饰是其mRNA及蛋白质表达下降的原因，该推测得到越来越多的研究证实［7］。本研究中，胃癌患者手术切除淋巴结中RUNX3基因启动甲基化率为66.7%，与报道的手术切除标本RUNX3基因启动子甲基化率基本一致，表明淋巴结与手术切除标本具有一致性。

进一步研究表明RUNX3基因启动子甲基化与胃癌的临床病理因素密切相关，这些因素包括淋巴结转移、远处转移及临床分期［8］，但这些研究均局限于对手术后切除肿瘤的研究。本研究中，胃癌患者手术切除淋巴结RUNX3基因启动子甲基化率在Lauren′s分型、组织学分级、肿瘤最大径、远处转移、TNM分期和手术方式中的差异有统计学意义（P＜0.05）。弥漫型、G3～G4、肿瘤最大径大于或等于5cm、有远处转移、TNM分期晚和姑息手术患者淋巴结RUNX3基因启动子甲基化率显著高于肠型、G1～G2级、肿瘤最大径小于5cm、无远处转移、TNM分期早和根治手术患者（P＜0.05）。

综上所述，Lauren′s分型、组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和TNM分期均是胃癌的预后影响因素，所以手术切除后淋巴结RUNX3基因启动子甲基化可作为胃癌病情及预后评估的标志物，与手术后切除的肿瘤一样均可为胃癌的病情及预后提供客观证据。

［1］Chuang LS，Lai SK，Murata-Hori M，et al.RUNX3interactome reveals novel centrosomal targeting of RUNX family of transcription factors［J］.Cell Cycle，2012，11（10）：1938-1947.

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［3］许洪卫，余燕民，蔡诚忠，等.淋巴结Runx3基因表达对胃癌患者生存的影响［J］.中华实验外科杂志，2011，28（3）：364-366.

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［5］Osaki M，Moriyama M，Adachi K，et al.Expression of RUNX3protein in human gastric mucosa，intestinal metaplasia and carcinoma［J］.Eur J Clin Invest，2004，34（9）：605-612.

［6］陈晓宇，朱兴国，陈晓蓉，等.RUNX3蛋白在不同分化胃癌、直肠癌组织中的表达变化［J］.解剖学杂志，2012，35（1）：27-30.

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