棉花耐盐相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记筛选

刘雅辉， 王秀萍， 鲁雪林， 张国新， 李 强

(河北省农林科学院滨海农业研究所，河北 曹妃甸 063200)

土壤盐渍化是影响农业生产的主要胁迫因子。中国的盐渍土近1.00×108hm2，且盐渍化和次生盐渍化土地面积不断扩大［1-2］。河北省盐渍土主要分布在沿渤海一带的秦皇岛、唐山、沧州等地，盐渍化面积大，盐碱程度高，土壤结构差，作物难以正常生长，严重影响了作物的产量和品质。因此合理开发利用盐碱地是一项迫在眉睫的任务。棉花是中国重要的经济作物，在国民经济中占有举足轻重的地位［3-4］。在粮棉争地矛盾日益突显的情况下，棉花以其较好的耐盐性，逐渐成为盐碱地一种新的优势作物。目前，中国是世界上盐碱地植棉规模最大的国家，据不完全统计［5］，中国植棉区内盐碱地约有 1.67 ×107hm2，其中超过2.67×106hm2已先后开发植棉。河北省的棉花种植面积也不断扩大，逐渐延伸到黑龙港地区和沿渤海一代的盐碱地区域。因此，培育和推广耐盐棉花新品种是提高盐碱地生产力的长久之计，也是目前盐碱地利用的一种有效手段。耐盐棉花品种一般需要有较强的出苗能力和抗盐能力，这给筛选和培育耐盐棉花品种提出了挑战，而分子标记技术不仅为棉花耐盐性筛选提供分子鉴定，同时也为新种质或品种的选育开辟了新的技术途径。

植物的耐盐性是一个及其复杂的性状，同时受环境和植物发育时间与空间的影响。有研究发现许多植物耐盐性状受少数主基因控制，存在耐盐主效基因［6-10］，因此通过寻找与耐盐基因密切连锁的分子标记，对于改善植物的耐盐性是可行且十分必要的。目前，在水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、苜蓿、结缕草等植物中，已检测到与耐盐相关的分子标记［11-19］，且部分已被定位和克隆［12-13，20-24］。到目前为止，有关棉花耐盐性分子水平的研究不多，与其相关的分子标记则更少。张丽娜等［25］通过SSR标记筛选出10对区分耐盐材料和敏盐材料的SSR引物，初步认为采用SSR标记可以鉴定棉花耐盐性;郭继坤［26］采用SSR标记以鲁棉97-8和苏12为亲本及184个单株的F2群体为材料，构建了一个包含8个连锁群、25个标记的遗传图谱，并定位了4个控制不同生育期耐盐性的QTLs。可见，筛选棉花耐盐性分子标记是切实可行的。

本研究拟以耐盐性差异大的两个亲本为材料利用SRAP技术和BSA法筛选与棉花耐盐相关的分子标记，然后用其杂交组合的F2分离群体及26份耐、敏盐品种(品系)对标记进行稳定性验证，以期获得与棉花耐盐相关的分子标记，从而为棉花耐盐种质鉴定及耐盐棉花分子标记辅助育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

选用耐盐材料NY1×敏盐材料中棉所12的F2分离群体，及26个耐、敏盐性品种(系)作为试验材料。26个耐(敏)盐品种通过河北省地方标准《棉花耐盐性鉴定评价技术规范》［27］鉴定，22个为耐盐品种，4个敏盐品种(表1)。

SRAP引物参照Li等［28］公布的通用引物，共组成88对引物，引物序列由北京华大基因研究中心合成。

表1 26份耐(敏)盐棉花材料名称、来源及耐盐性Table 1 Names，sources and salinity tolerance of 26 cotton materials

1.2 试验方法

1.2.1 F2群体的耐盐性鉴定 试验于2013年5月在河北省农林科学院滨海农业研究所现代农业科技成果转化基地盐碱原土鉴定池进行。在土壤全盐含量0.1%的对照池种植30株F2，在土壤全盐含量0.4%的处理池种植400株F2，待棉花长至1～2叶期时，随机抽取312个单株进行耐盐鉴定。按照河北省地方标准《棉花耐盐性鉴定及评价技术规程》中的苗情分类标准(表2)统计耐盐与敏盐单株，盐害级别为0、1、2级的植株全部记载为耐盐，3、4级的记载为敏盐。

1.2.2 DNA提取 利用北京康为世纪生物科技有限公司生产的 CottonGenDNAkit提取供试材料DNA，然后用北京普析通用仪器有限责任公司生产的TU-1810紫外分光光度计检测 DNA纯度与浓度。

1.2.3 DNA池的构建 从NY1×中棉所12的F2分离群体中随机选择耐盐植株和敏盐植株各20株，分别提取其基因组DNA并测定其浓度，稀释后分别按等量混合后构建F2耐盐池和敏盐池。

1.2.4 PCR扩增和产物检测 PCR反应总体系为20.0 μl，其中10 × Buffer 2.0 μl，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μl，5 U/μl 的 Taq 酶 0.2 μl，30 ng/μl的模板DNA 1.0 μl，正反引物(50 ng/μl)各 0.7 μl，PCR染料 2.0 μl，然后加双蒸水补齐 20.0 μl。

PCR反应在Eppendorf mastercycler gradient基因扩增仪中进行。PCR扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸10 min，进行5个循环后退火变为50℃，再进行30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存扩增产物，在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测带型。

表2 棉花盐害级别分类标准Table 2 The classification of salt injury grade in cotton

2 结果与分析

2.1 棉花耐盐SRAP分子标记的筛选

用88对SRAP引物(8个正向引物和11个反向引物组成)对2个棉花亲本进行PCR扩增，筛选出清晰稳定、具有多态性条带的引物6对。然后用这6对引物对F2群体耐、敏基因池进行扩增，筛选出1对引物(me3-em5)在耐盐亲本和耐盐池中均能扩增出一条约为350 bp的特异片段，而在敏盐亲本和敏盐池中未扩增出该片段(图1)。

2.2 棉花耐盐SRAP分子标记在F2分离群体中的鉴定

将筛选到的引物组合me3-em5对F2代中随机选取的312株耐、敏盐单株DNA进行扩增，进行稳定性验证，结果(图2)显示，在230株耐盐单株中有226株能扩增出此特异片段，而在82株敏盐单株中有80株没有扩增出该片段，2株扩增出这一片段，可以看出F2代分离群体中出现6个重组个体，重组率为1.92%。

2.3 棉花耐盐SRAP分子标记在不同棉花品种中的鉴定

图1 引物组合me3-em5在棉花两亲本及耐、敏池间的扩增Fig.1 Amplification of cotton parents，salt tolerant and salt sensitive pools with me3-em5

图2 引物组合me3-em5在F2部分耐、敏盐单株间的扩增Fig.2 Amplification of salt tolerant and salt sensitive F2plants with me3-em5

对22个耐盐品种和4个敏盐品种进行PCR分析，结果(图3)显示，22个耐盐品种中20个品种均扩增出350 bp特异条带，只有中棉所35和邯棉5158扩增出的条带稍有下移接近300 bp，4个敏盐品种中均没有扩增出此条带。除了中棉35和邯棉5158有细微差别外，其他品种盐池鉴定结果与分子标记鉴定结果基本一致。

图3 引物组合me3-em5在不同材料中的扩增Fig.3 Amplification of salt tolerant and sensitive cotton varieties with me3-em5

3 讨论

棉花的耐盐性不但受到棉花本身遗传因素影响，还受外界环境及栽培措施的影响，其耐盐机制至今还没形成统一认识，很多领域尚存在争论［29］。沈法富等［10］通过双列杂交对6个耐盐性不同的品种进行分析，结果表明，棉花的耐盐性存在着加性和显性效应，以加性效应为主，耐盐性呈不完全显性，受一对主效基因控制。张丽娜等［25］利用SSR技术对两个典型的耐盐品种和敏盐品种进行了多态性引物筛选，初步获得了10对引物，有望成为鉴定棉花耐盐性的标准引物。

为了减少不同遗传背景的影响，本研究利用SRAP标记技术和BSA法寻找棉花耐盐相关的分子标记，共筛选了88对引物，其中有6对引物在两亲本间产生特异带，且带型清晰稳定，重复性较好。然后对筛选出的多态性引物在F2群体耐盐池和敏盐池间扩增，1对引物在耐盐池产生350 bp大小的条带，而在敏盐池没有扩增出此条带，推测该扩增产物可能是与棉花耐盐性连锁的分子标记。对F2分离群体大量单株的扩增中，出现了4个重组个体，重组率为1.92%，说明该标记与耐盐性不能共分离，但是与耐盐性连锁程度较为紧密。通过26个耐、敏盐品种(品系)的验证，证实了4个敏盐材料中均没有扩增出该产物，而22个耐盐材料中基本上扩增了该产物，只是在极个别材料中发生了轻微变化，这种现象说明了在不同的材料中，标记片段的大小会发生改变，这可能是不同的遗传背景或是不同的环境条件所致。通过研究，基本可以断定该片段是与棉花耐盐性状紧密连锁的分子标记。

由于棉花基因组序列很大，一旦获得与耐盐性状紧密连锁的标记，就证明了标记的可行性和可用性。本研究首次应用SRAP分子标记技术对棉花耐盐性进行遗传标记分析，最终筛选获得1个与棉花耐盐密切相关的SRAP分子标记，为棉花耐盐性鉴定提供了一种快速有效的方法，从而促进棉花耐盐性分子标记辅助育种的进程，也为棉花耐盐基因的定位、克隆奠定良好的基础。但是，该研究中只用了一组杂交组合及F2群体为材料，而耐盐性是一个比较复杂的数量性状，单一耐盐、敏盐亲本的选择，可能会影响到结果的准确性，未来研究应该再增加杂交组合数或建立永久的分离群体，寻找更多与耐盐性连锁的分子标记，以期准确定位与棉花耐盐相关的QTL。

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