牛肉及其制品中肉类掺假的荧光PCR鉴别体系优化

陈涓涓，赵 晨，宋 帆，邱希斌，许任伟，韩 涛，林 钊，王永辉

(1．福州大学化学学院，福建福州 350116;2．福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002)

0 引言

牛肉及其制品因其营养丰富，深受人们的喜爱．在一些少数民族地区如新疆、宁夏等地，牛肉及其制品更是人们食用的主要肉类之一．但随着牛肉香精、牛肉膏等食品添加剂的发展，不法商贩将其添加到猪肉、禽肉中，经过加工冒充牛肉，以赚取超额的利润．这些掺假牛肉及其制品扰乱了市场经济秩序，影响了我国正在建设的社会诚信体系．更重要的是，由于伊斯兰教禁食猪肉，一旦掺假牛肉流入西北少数民族地区，极易引起民族矛盾，危害社会的和谐稳定．

目前，肉类制品通常经过切片、腌渍、烟熏等加工过程，通过感观鉴别等手段已无法对肉类品质准确鉴别［1］．聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种使特定核酸片段在体外大量复制的技术，利用这一技术，可以让目标物种的特异DNA片段进行大量复制而进行检测，以鉴别肉制品中是否掺入其他物种．相比于其他检测手段，PCR检测技术具有特异性好，灵敏度高等优势，可以准确地为政府监管提供有利证据［2－5］．

现在大多数应用荧光PCR技术进行的物种鉴别，主要是针对饲料样品，而食品相对较少［6－10］．同时，样品较为单一，对多种不同肉类掺入牛肉产品的问题研究较少．因此，本研究对牛肉及其制品中常见的掺假肉类——猪肉、鸡肉和鸭肉，设计相应的引物和探针，证明其特异性，并优化PCR条件，建立起一套专门针对牛肉及其制品掺假的荧光PCR鉴定体系，并测试该方法优化后的特异性和实际应用性．

1 材料与方法

1．1 材料

牛肉和猪肉购自福建省福州市山姆会员店，鸡肉和鸭肉购自福建省福州市永辉超市．

1．2 试剂与仪器

Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、MgCl225 mmol·L－1、dNTP、loading缓冲液、蛋白酶(日本TAKARA公司);去离子水(天根生化科技北京有限公司);Minispin台式离心机(德国Eppendorf公司);MS 3基本型漩涡混合仪(德国IKA公司);DB－3D热块加热器(英国TECHNE公司);DNA 120 DNA浓缩仪(美国Thermo公司);7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司);Hfsafe1200生物安全柜(上海力申公司)．

1．3 引物和探针的合成

［11－15］，由上海基康生物技术有限公司合成4对荧光引物及其相应的探针，具体见表1．

表1 引物和探针DNA序列Tab．1 DNA sequences of the primers and probes

1．4 DNA 提取

用异硫氰酸胍法提取DNA．用核酸蛋白质测定仪测定浓度，并将样品DNA稀释至200 ng·μL－1．

1．5 荧光PCR反应初始体系及温度循环程序

荧光PCR反应初始体系及温度循环程序详见表2和表3．

表2 各成分荧光PCR反应初始体系(总体系体积为50μL)Tab．2 Original real－time PCR system(total volume is 50 μL)

表3 各成分荧光PCR温度循环程序(循环数为45)Tab．3 The thermal program for real－time PCR(cycle number is 45)

1．6 荧光PCR反应体系优化

在表2的反应体系基础上，对体系中的MgCl2浓度，dNTPs浓度，Taq酶活，引物及探针浓度和DNA模板用量5个因素进行逐个优化，各动物源性各因素设置梯度见2．2节．

1．7 检测限的测定

将猪肉、鸡肉和鸭肉，分别按其占混合样品总重的不同比例，与牛肉混合．提取混合样品的DNA后根据优化好的PCR扩增条件对猪肉、鸡肉和鸭肉进行荧光PCR检测．以最低能够检测到的混合样中猪肉、鸡肉和鸭肉的含量作为方法的最低检测限．

1．8 实际市售样品的检测

随机选取市场流通的6种牛肉制品(不确定样品中是否存在掺假)，提取其DNA后，根据优化好的扩增条件进行荧光PCR检测其是否存在掺假．市售样品信息如下:牛肉干A，福州市某食品有限公司，为实验室送检样品;牛肉干B，龙海市某食品有限公司，为实验室送检样品;牛肉丸，未知厂家，来自福州市福大农贸市场;牛肉松，龙海市某食品厂，来自福州市永辉超市;牛肉酱，龙岩市某食品有限公司，来自福州市永辉超市;冷冻牛排，福州市某冷冻食品厂，来自福州市山姆会员店．

2 结果与分析

2．1 荧光PCR引物的特异性验证

分别使用5种目标物种的DNA为模板，以表2中的各自反应体系和表3中的反应程序对上述5对荧光引物以及探针进行特异性验证，结果见图1．

图1 四对荧光引物及其探针的特异性实验Fig．1 The specificity results of four pairs primers and probes

由图1可知，4对荧光引物及其探针均有良好的特异性，只对目标DNA模板可进行扩增，循环阈值(cycle threshold，Ct)均小于35;其他非目标模板DNA及阴性对照在45个循环内均未出现扩增曲线．但是在初始PCR体系中非目标模板DNA有少许抬高，基线不是很平．因此，对其各自的荧光PCR体系进行优化，以期获得更小的Ct值或是出现典型的扩增曲线或是非目标模板DNA的基线更加平整．

2．2 荧光PCR反应体系的优化

所有成分荧光PCR反应体系均按照以下顺序依次进行优化:Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶活、模板DNA用量(表4～7)．每次优化时，固定已优化的因素，除要优化的因素外，其余因素按照初始体系中的浓度和用量．由于各初始反应体系中各因素的浓度或用量差异比较大，而且均为不同的引物，因此优化因素的浓度或用量梯度设置不一样．

从表4～7的结果可知，Ct值，ΔRn值(ΔRn=R+n－R－n，其中，R+n表示每点测量的荧光强度，R－n表示荧光基线强度)以及扩增曲线形状均随着Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶活、引物和探针浓度优化以及模板DNA用量的变化而有相应的变化，综合考虑Ct值、ΔRn值以及扩增曲线的反应平台(以出现95%ΔRn最大值所对应的Ct值来表示)等结果来决定最佳浓度或最佳用量．

牛肉成分荧光PCR反应优化:根据表4中的结果，得到牛肉成分荧光PCR反应的最佳体系是4 mmol·L－1(H梯度)Mg2+浓度、300μmol·L－1(G 梯度)dNTPs浓度、5．0 U(C 梯度)的 Taq DNA 聚合酶活、0．48μmol·L－1(F梯度)的引物浓度和探针浓度、≥0．004 ng的DNA模板浓度．

猪肉成分荧光PCR反应优化:根据表5中的结果，得到猪肉成分荧光PCR反应的最佳体系是2 mmol·L－1(D 梯度)Mg2+浓度、75μmol·L－1(C 梯度)dNTPs浓度、2．5 U(C 梯度)的 Taq DNA 聚合酶活、0．3μmol·L－1(E梯度)的引物浓度和探针浓度、≥0．4 ng的DNA模板浓度．

表4 牛肉成分荧光PCR反应体系的优化结果(黑体字为优化后的浓度和Ct值)Tab．4 Optimization results of bovine－derived real－time PCR system(bold numbers is concentrations and Ct values after optimization)

表5 猪肉成分荧光PCR反应体系的优化结果(黑体字为优化后的浓度和Ct值)Tab．5 Optimization results of pork－ derived real－time PCR system(bold numbers is concentrations and Ct values after optimization)

表6 鸡肉成分荧光PCR反应体系的优化结果(黑体字为优化的浓度和Ct值)Tab．6 Optimization results of chicken －derived real－time PCR system(bold numbers is concentrations and Ct values after optimization)

续表6

表7 鸭肉成分荧光PCR反应体系的优化结果(黑体字为优化的浓度和Ct值)Tab．7 Optimization results of duck －derived real－time PCR system(bold numbers is concentrations and Ct values after optimization)

鸡肉成分荧光PCR反应优化:根据表6中的结果，得到鸡肉成分荧光PCR反应的最佳体系是3 mmol·L－1(E 梯度)Mg2+浓度、150μmol·L－1(D 梯度)dNTPs浓度、2．0 U(C 梯度)的 Taq DNA 聚合酶活、0．2μmol·L－1(D 梯度)的引物浓度和0．1μmol·L－1(D 梯度)的探针浓度，≥0．4 ng的 DNA 模板浓度．

鸭肉成分荧光PCR反应优化:根据表7中的结果，得到鸭肉成分荧光PCR反应的最佳体系是1．5 mmol·L－1(E 梯度)Mg2+浓度、100μmol·L－1(E 梯度)dNTPs浓度、5．0 U(C 梯度)的Taq DNA 聚合酶活、0．3μmol·L－1(C梯度)的引物浓度和探针浓度、≥0．004 ng的DNA模板浓度．

2．3 荧光PCR引物优化后的特异性验证

为了验证各成分荧光PCR引物优化的特异性以及优化后的扩增效果，以各自优化后的反应体系(见表8)进行扩增．由图2可知Ct值在优化后没有明显的变化．但利用优化后的反应体系进行扩增引物仍然具有良好的特异性，同时非目标的源性模板DNA的扩增曲线与空白对照组基本重合在一起，比优化前更平更好．这种明显特异性的扩增曲线更有利于检验工作中的快速判定．

表8各成分荧光PCR反应最终体系(总体系体积为50μL)Tab．8 Final real－time PCR system in this study(total volume is 50 μL)

图2 四对荧光引物及其探针优化后的特异性实验Fig．2 The specificity results of foure pairs primers and probes after optimization

2．4 检出限测试

将猪肉、鸡肉和鸭肉，分别按其占混合样品总重的不同比例与牛肉混合后提取DNA，根据优化好的荧光PCR扩增条件进行检测．从表9的测试结果可以看出，猪肉、鸡肉、鸭肉三种掺假成分含量在0．1%～10%(质量分数，以下均同)之间时，均可以通过荧光PCR方法检测出来，但当掺假成分下降到0．01%时，鸭肉未能被检测出来．因此，尽管荧光PCR检测方法可以检测到0．01%含量的鸭肉，但整体检出限还是定为0．1%更为合适．

表9 混合样品中不同含量掺假成分荧光PCR检测结果Tab．9 The identification results of different adulteration components in mixed samples

2．5 市售样品检测

随机选取市场流通的6种牛肉制品(不确定样品中是否存在掺假)，按照建立的掺假鉴别方法进行荧光PCR检测其是否存在掺假．由表10的结果可以看出，在市售的样品中，牛肉干A和冷冻牛排均未检出猪肉、鸡肉和鸭肉，说明这两个样品不存在这四种成分的掺假．但是，牛肉干B、牛肉丸、牛肉松和牛肉酱样品均有不同掺假成分被检测出来．其中，牛肉松在配料表中注明含有鸡肉，牛肉酱在配料表中注明含有猪肉．而牛肉干B和牛肉丸样品分别检测出猪和鸡成分，同时样品配料表中并未注明各自含有猪或鸡成分，说明这两个样品存在掺假的可能．

表10 市售样品检测结果Tab．10 The identification results of commercial beef products

3 结语

随着添加剂的使用，牛肉及其制品掺假事件频发，肉制品掺假已成为公众关注的热点问题之一．荧光PCR具有特异性高、灵敏度强、样品量少、简便快速等优点，克服了传统感观和理化鉴定的准确度低、灵敏度差、时耗长、需要经验等缺点，已成为对动物源性成分进行检测的重要技术方法．但是目前国内尚未建立一个完整的荧光PCR鉴定方法对牛肉及其牛肉制品有可能掺假的来源进行检测．根据可能常作为原料掺入牛肉的不同肉类成分(猪肉、鸡肉、鸭肉)设计相对应物种的特异性引物和探针，证明其特异性．在初始的PCR反应体系的基础上，对影响荧光PCR的5个因素包括Mg2+终浓度、dNTPs终浓度、Taq DNA聚合酶活、引物和探针终浓度以及模板DNA用量进行逐一优化，确定各自荧光PCR的最佳反应体系．最后，对优化前后的效果进行比较．结果表明，优化后的反应体系不仅使引物和探针仍然具有良好的特异性，同时能够使非目标扩增曲线更加平整，有利于检测的判断．使用建立的优化荧光PCR鉴别体系对混合样品和市售样品进行检测，确定整体检出限为0．1%，证明了该鉴别体系的实际应用价值．

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