野生小鼠来源1号染色体替换系小鼠的生长表型与血液生化检测

高遄，徐伟，徐福意，张耀奇，赵莹，赵丽亚，周宇荀，李凯* ，肖君华

(1.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620;2.上海实验动物研究中心，上海 201203)

由于与人类在遗传、生理和生化方面惊人的相似度，小鼠作为模式生物来研究决定生理性状的基因颇具历史［1］。数以千计的数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)已经在小鼠基因组上被定位，主要使用经典的同源导入近交系法［2］。由于该法受限于已有近交系小鼠群体的低分辨率QTL 定位精度［3，4］，Nadeau 等［5－10］在2000年左右提出的染色体替换系群体加速了QTL 的定位与基因发现研究。染色体替换系群体是将供体品系中一根完整的染色体通过回交方式转入到受体品系的基因背景中，再通过回交的方式使得99%以上的基因背景与受体品系完全相同［5，10，11］。由于排除了基因的相互作用以及多重QTL 的共分离作用，在染色体替换系群体中观察到的表型差异往往比不同品系间的差异更明显［9－11］。

早期的染色体替换系群体，多将一近交系的染色体替换至另一近交系小鼠，如A/J 和B6 之间的染色体替换群体对焦虑表型的QTL 研究［12］，以及通过MSM 小鼠与B6 替换系群体定位代谢相关QTL［10］。然而，经典近交系小鼠的染色体替换系群体与自然群体相比QTL 的数量非常有限，从而影响表型的差异以及基因座的发现［13］。研究发现野生小鼠群体与实验室近交系小鼠相比具有更为广泛的连锁不平衡和更多的等位基因，这些发现使得野生小鼠成为发掘QTL 的更为理想的模式生物［2，14，15］。

本课题组自2007年起，开始收集中国野生小家鼠资源，并培育1 号染色体替换群体。迄今已累计回交7 代以上，并已近亲交配2 代以上。本文就其中9 个野生小家鼠1 号染色体替换系的体重、体长。尾长变化等生长发育特性与内脏器官重量和血液生化指标进行了一系列测定，以分析其性状异同。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本课题组培育的9 个染色体替换品系小鼠:B6-Chr1CM(简称CM)，B6-Chr1HZ(简称HZ)，B6-Chr1KM(简 称KM)，B6-Chr1SJ3(简 称SJ3)，B6-Chr1SMX(简称SMX)，B6-Chr1TW(简称TW)，B6-Chr1ZC(简 称ZC)，B6-Chr1ZZ1(简 称ZZ1)，B6-Chr1ZZ2(简称ZZ2)。对照组C57BL/6 小鼠(简称B6)，购自上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK(沪)2012-0002］。饲料为上海西普尔-必凯实验动物有限公司生产的大小鼠高压饲料。染色体替换品系小鼠的饲养繁殖实验在东华大学实验动物设施内［SYXK(沪)2014-0022］进行。

用于检测生长曲线的小鼠每个品系个数和回交、自交代数见表1。

表1 生长发育检测用小鼠数量及自交代数Tab.1 The mice used for growth phenotyping

1.2 主要试剂与仪器

血液生化试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，碱性磷酸酶(ALP)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，尿酸(UA)，总胆红素(TB)，葡萄糖(GLU)，肌酐(CRE)均购买自上海科华生物工程股份有限公司。使用上海科华生物工程股份有限公司生产的KHB 卓越310 全自动生化分析仪检测上述指标。

1.3 实验方法

1.3.1 体重测量

各品系分别选取一定数量的雌性和雄性小鼠(见表1)，由出生第一天起，每2 天测量一次体重，直至第31 天;由43(第6 周)天开始每周测量一次体重，直至第85 天(第12 周)。

1.3.2 体长测量

抓取小鼠后使用直尺测量小鼠鼻尖到尾巴根部的长度，测量频率与体重测量相同。

1.3.3 尾长测量

抓取小鼠后使用直尺测量小鼠尾根到尾尖的长度，测量频率与体重测量相同。

1.3.4 血液生化测量

取日龄为85d 后的小鼠在采血前14h 隔夜禁食，保留饮用水。采用眼眶静脉丛采血法，采取血液后放置于4℃冰箱内4h 后，3000 r/min 离心10 min，取上层血清保存进行实验。溶血的样本丢弃。

1.3.5 器官重量测量

小鼠在采血后立即使用颈椎脱臼法处死，用75%乙醇浸泡消毒全身后，固定于解剖板上，使用眼科手术剪与眼科手术钳依次摘取心脏、肝脏、肺、脾脏、肾脏、脑部，并称重。

1.3.6 脏器系数

器官重量占体重的比例，以百分比形式表示。

1.4 统计方法

体重、体长、尾长以出生第1 天、第19 天、第31天和第85 天的数据统计分析。使用SPSS 20.0 软件，数据以均数±标准差形式表示，各组数据使用t检验与B6 小鼠的数据进行比较，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 小鼠生长曲线

2.1.1 体重变化

由生长曲线图(图1A，B)可知，体重增长速度可分为三个阶段，较快期间为第1 ～19 天，最快期间为19 ～31d，31d 后进入平缓增长。故以出生第1、19、31 和85 天作为节点详细分析。

出生第1 天，B6 雌鼠体重最低且与KM(P =0.000)、ZZ1(P =0.014)、TW(P =0.031)的雌鼠具显著差异;雄鼠中B6 显著低于KM(P =0.013)。第19 天，KM 雌鼠体重显著高于B6(P =0.004);SJ3 雄鼠显著轻于B6(P =0.0265)。第31 天雌鼠中，KM 体重显著高于B6(P =0.023)，而SJ3(P =0.005)、CM(P =0.010)和HZ(P =0.025)体重显著低于B6;雌鼠中，KM 体重显著高于B6(P =0.001)，SJ3(P =0.031)和TW(P =0.044)体重显著低于B6。第85 天，KM 显著高于B6(KM 雌P =0.005，KM 雄P =0.000)，以及TW 显著低于B6(TW 雌P=0.006，TW 雄P =0.001)。所有的替换系小鼠群体中，KM 雌鼠和雄鼠在体重上从出生开始一直高于其他品系小鼠。

图1 替换系群体小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)体重变化Fig.1 Growth curves of the chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

2.1.2 体长

体长变化如图2(A，B)所示。第1 ～19 天增长速度最快，19 ～31d 次之，31d 以后最为平缓。

替换系群体的新生鼠与B6 差异无显著性。第19 天时仅KM 雌鼠体长显著大于B6(P =0.002)。第31 天雌鼠中，CM(P =0.001)、SJ3(P =0.001)、HZ(P = 0.013)、SMX(P = 0.028)与ZZ1(P =0.043)5 个品系的雌鼠体长显著低于B6;雄鼠中，KM 显著高于B6 雄鼠(P=0.006)，SJ3 显著低于B6(P=0.012)。第85 天时，雌鼠中仅CM 显著小于B6(P = 0.039);雄鼠中，仅SMX 小于B6(P =0.023)。

2.1.3 尾长

尾长变化如图3(A，B)所示，曲线趋势与体长类似。

图2 替换系群体小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)体长变化Fig.2 Body length curves of the male chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

新生替换系群体小鼠与B6 差异无显著性。第19 天，雌鼠中HZ(P = 0.001)、CM(P = 0.001)、SMX(P=0.015)、ZZ2(P =0.028)4 个品系的尾长显著低于B6;雄鼠中HZ(P =0.000)、SMX(P =0.000)、SJ3(P =0.000)、CM(P =0.000)、ZZ2(P =0.001)显著低于B6。第31 天时，雌鼠中HZ(P =0.001)、SMX(P =0.002)、ZZ2(P =0.005)、CM(P=0.009)显著短于B6;雄鼠中，SMX(P =0.000)、CM(P=0.000)、HZ(P=0.000)、ZZ2(P =0.000)、SJ3(P=0.001)显著短于B6。第85 天，雌鼠中KM显著长于B6 显著(P =0.012)，而CM(P =0.000)、HZ(P=0.000)、SJ3(P=0.000)、SMX(P =0.000)、TW(P =0.000)、ZC(P =0.001)、ZZ1(P =0.013)、ZZ2(P=0.000)这8 个品系均低于B6 且差异有显著性。

2.2 替换系小鼠主要器官脏器系数

各品系小鼠主要器官的脏器系数如表2 所示。

图3 替换系群体小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)尾长变化Fig.3 Tail length curves of the chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

各品系小鼠心脏与B6 差异无显著性。在肝与肺脏器系数上，均仅KM 雄鼠显著低于B6;在脾脏器系数上，HZ 雌鼠与KM 雄鼠显著低于B6;在肾脏器系数上，KM 雄鼠、TW 雌鼠、ZC 雌雄鼠、与ZZ1 雄鼠显著低于B6，ZZ2 雄鼠显著高于B6;在脑脏器系数上，雌鼠中仅KM 低于B6，雄鼠中CM、HZ、KM、SMX、ZZ1 与ZZ2 均显著低于B6，TW 雄鼠显著高于B6。

2.3 血液生化指标测定结果

总计13 个指标中，ALB、AST、CRE、GLU、UA、TP、HDL 和LDL 等8 个指标与B6 相比差异无显著性，其余5 个指标中存在替换系小鼠与B6 差异有显著性(表3)。

ALP 结果显示，HZ 雌鼠显著高于B6(P =0.001);KM 雄鼠显著低于B6(P =0.031);ALT 结果显示，CM 雌鼠显著高于B6(P =0.011);TB 的结果显示，雄鼠中CM(P =0.000)、SMX(P =0.000)与HZ(P =0.041)均显著高于B6;TG 结果显示，SMX 雄鼠显著高于B6(P =0.044);TC 结果显示，TW 雄鼠显著高于B6(P=0.005)。

表2 脏器系数Tab.2 Organ coefficients of the mice

表3 替换系群体小鼠与B6 存在显著差异的血液生化指标(±s)Tab.3 Blood biochemical indexes with significant differences between the chromosome substitution strain and B6 mice

表3 替换系群体小鼠与B6 存在显著差异的血液生化指标(±s)Tab.3 Blood biochemical indexes with significant differences between the chromosome substitution strain and B6 mice

品系Strains数量n性别Sex碱性磷酸酶ALP U/L丙氨酸氨基转移酶ALT U/L总胆红素TB μmol/L甘油三酯TG mmol/L总胆固醇TC mmol/L B6 10 ♀ 89.89 ±26.14 24.3 ±8.63 1.54 ±0.46 0.62 ±0.22 1.99 ±0.36 11 ♂ 70.1 ±24.93 37.91 ±21.71 1.87 ±0.63 1.2 ±0.32 2.41 ±0.42 CM 11 ♀ 84.45 ±26.42 66 ±44.82* 2.65 ±1.72 0.61 ±0.16 1.77 ±0.79 13 ♂ 71.58 ±17.17 46.92 ±29.72 3.68 ±0.64 1.29 ±0.81 2.34 ±0.62 HZ 16 ♀ 126.31 ±35.89* 42.5 ±25.44 2.43 ±0.61 0.88 ±0.32 2.63 ±0.7 10 ♂ 90.56 ±21.08 32.67 ±15.09 3.12 ±1.07* 0.74 ±0.22 2.23 ±0.55 KM 10 ♀ 70 ±33.7 34.6 ±10.17 0.94 ±0.46 0.82 ±0.54 1.37 ±0.86 10 ♂ 48.36 ±26.74* 35.27 ±9.76 1.59 ±0.44 0.97 ±0.42 1.97 ±0.79 SJ3 12 ♀ 81.58 ±21.18 38.67 ±11.23 2.06 ±0.7 0.99 ±0.61 2.35 ±0.51 12 ♂ 59.08 ±24.42 31.75 ±9.83 2.56 ±0.47 1.04 ±0.29 2.45 ±0.75 SMX 14 ♀ 78.79 ±33.96 38.36 ±28.31 1.98 ±0.48 1.29 ±0.9 2.36 ±0.52 9♂ 49.11 ±25.85 47.22 ±31.48 3.31 ±1.26 1.69 ±0.92* 2.92 ±0.81 TW 14 ♀ 104.86 ±34.79 42.21 ±19.92 1.64 ±0.46 0.92 ±0.37 2.9 ±1.06 16 ♂ 73 ±21.38 45.81 ±28.07 2.3 ±0.59 1.24 ±0.42 3.7 ±0.93*ZC 7 ♀ 92.88 ±21.52 50.88 ±18.19 1.31 ±0.44 0.8 ±0.16 2.6 ±0.49 10 ♂ 69 ±21.72 44.45 ±16.18 1.91 ±0.57 1.15 ±0.25 2.59 ±0.57 ZZ1 15 ♀ 67 ±21.54 42.6 ±23.02 2.19 ±0.47 0.82 ±0.21 2.61 ±0.55 11 ♂ 49.78 ±23.63 35.55 ±17.58 2.77 ±0.69 1.05 ±0.27 2.27 ±0.61 ZZ2 16 ♀ 92.75 ±30.64 42.31 ±20.74 2.67 ±0.73 0.91 ±0.34 2.21 ±0.97 12 ♂ 70.58 ±13.07 42.09 ±23.65 2.88 ±0.65 1.06 ±0.38 2.36 ±0.51

3 讨论

在本研究中，对9 个野生小鼠来源对的1 号染色体替换系小鼠进行了表型检测，发现在体长、体重、尾长，以及心脏、肾脏、脑部重量，丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、甘油三酯、总胆固醇这些指标上都存在着替换系群体小鼠与B6 显著差异。

纵观替换系小鼠整体生长过程，特别是体重曲线上，大部分品系在不同时间段的生长速度存在2个转折点。1 ～19 d 时，生长速度较快，而19 ～31 d左右生长速度最快，31 d 以后，增长则较为平缓，并且品系之间的差异逐渐明显，这一趋势与先前结果基本一致［10］。

器官重量上总体差异不大，但在脏器系数上差异明显。除心脏外的其他器官，替换系与B6 均存在显著差异。体重、体长在内的生长发育是由多个过程控制调节的，包括细胞增殖与生长，细胞的位置，细胞的凋亡［16］。此外，已经发现身体发育和器官大小是由多个染色体影响的，因此仍有QTL 挖掘的空间。

不同的染色体替换系品系小鼠在血液生化指标表现出较大的变异，如:TW 雌雄鼠在高密度脂蛋白、总胆固醇上的高数值;SMX 雌雄鼠在甘油三酯上显示出的高数值。B6-A/J 的染色体替换系的研究中，在不同染色体上发现了7 个影响雄鼠血清胆固醇的QTL［8］，而在B6-M/m 的研究中则发现有14个染色体与胆固醇相关［10］。血液生化、解剖学的QTL 由基因和环境因素共同控制，但是自然环境累积的高度选择压力，使野生来源小鼠的表型在容易出现极端表型［17］。

基因背景的差异对于小鼠的生长发育、血液生化等表型都有非常大的作用。目前已有超过400 个控制重要生理生化性状的QTL 在小鼠1 号染色体上被发现［10，13，18，19］。这些QTL 可以认为是前人完成的科研“半成品”，需进一步的精细定位以便克隆相关基因。野生来源小鼠的许多指标已经展现出与基因功能研究的相关性［20，21］，是系统研究复杂性状新通路和新调控方式的潜在资源［3，22］。随着DNA测序技术的快速发展，高通量的基因组测序数据已经远快于生理生化数据的产出，然而表型数据仍是揭示基因功能的重要基础［23］。

［1］O’Brien T，Woychik R.Our small relative ［J］.Nat Genet，2003，33:3 －4.

［2］Laurie CC，Nickerson DA，Anderson AD，et al.Linkage disequilibrium in wild mice［J］.PLoS Genet，2007，3(8):e144.

［3］Guenet JL，Bonhomme F.Wild mice:An ever-increasing contribution to a popular mammalian model［J］.Trends Genet，2003，19(1):24 －31.

［4］Wade CM，Kulbokas EJ，Kirby AW，et al.The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome［J］.Nature，2002，420:574 －578.

［5］Nadeau JH，Singer JB，Matin A，et al.Analysing complex genetic traits with chromosome substitution strains［J］.Nat Genet，2000，24(3):221 －225.

［6］Matin A，Collin GB，Asada Y，et al.Susceptibility to testicular germ-cell tumours in a 129.MOLF-Chr 19 chromosome substitution strain［J］.Nat Genet，1999，23:237 －240.

［7］Cowley AW Jr，Roman RJ，Kaldunsk ML，et al.Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat［J］.Hypertension，2001，37(2):456 －461.

［8］Singer JB，Hill AE，Burrage LC，et al.Genetic dissection of complex traits with chromosome substitution strains of mice［J］.Science，2004，304(5669):445 －448.

［9］Shao H，Burrage LC，Sinasac DS，et al.Genetics architecture of complex traits:large phenotypic effects and pervasive epistasis［J］.Proc Natl Acad Sci，2008，105(50):19910 －19914.

［10］Takada T，Mita A，Maeno A，et al.Mouse inter-subspecific consomic strains for genetic dissection of quantitative complex traits［J］.Genome Res，2008，18(3):500 －508.

［11］Gregorova S，Divina P，Storchova R，et al.Mouse consomic strains:exploiting genetic divergence between Mus m.musculus and Mus m.domesticus subspecies［J］.Genome Res，2008，18(3):509 －515.

［12］Singer JB，Hill AE，Nadeau JH，et al.Mapping quantitative trait loci for anxiety in chromosome substitution strains of mice［J］.Genetics，2005，169(2):855 －862.

［13］Xiao J，Liang Y，Li K，et al.A novel strategy for genetic dissection of complex traits:the population of specific chromosome substitution strains from laboratory and wild mice［J］.Mamm Genome，2010，21(7 －8):370 －376.

［14］Salcedo T，Geraldes A，Nachman MW.Nucleotide variation in wild and inbred mice［J］.Genetics，2007，177(4):2277 －2291.

［15］Mott R，Flint J.Prospects for complex trait analysis in the mouse［J］.Mamm Genome，2008，19(5):306 －308.

［16］Conlon I，Raff M.Size control in animal development［J］.Cell，1999，96(2):235 －244.

［17］Zhou Y，Liang Y，Li K，et al，The phenotypic distribution of quantitative traits in a wild mouse F1 population［J］.Mamm Genome，2012，23(3 －4):232 －240.

［18］Champy MF，Selloum M，Zeitler V，et al，Genetic background determines metabolic phenotypes in the mouse［J］.Mamm Genome，2008，19(5):318 －331.

［19］http:www.informatics.jax.org

［20］管彤，张静姝，李大鸣，et al.TW 近交系小鼠的血液生化及毛色基因检测［J］.中国比较医学杂志，2012，22(4):39 －42

［21］张婷婷，仝莉，肖君华，等.特异区段替换小鼠性发育表型的研究［J］.中国实验动物学报，2013，21(2):1 －7

［22］Peters LL，Robledo RF，Bult CJ，et al.The mouse as a model for human biology:a resource guide for complex trait analysis［J］.Nat Rev Genet，2007，8:58 －69

［23］Brown SD，Hancock JM，Gates H.Understanding mammalian genetic systems:the challenge of phenotyping in the mouse［J］.PLoS Genet，2006，2(8):1131 －1137.