蛇伤药酒的薄层鉴别及其盐酸小檗碱含量测定*

*基金项目: 新会区科技局项目(新科[2014]523号)；江门市科技局项目(江科[2014]77号)。

**第一作者：昌水平,男,副主任中药师。Tel：(0750)6621115，E-mail:zyysbk001@126.com。

★　昌水平1**　张健民1　王琦2　梁志云1　(1.江门市新会区中医院　广东 江门 529100；2.江门市药品检验所　广东 江门 529000)

蛇伤药酒的薄层鉴别及其盐酸小檗碱含量测定*

*基金项目: 新会区科技局项目(新科[2014]523号)；江门市科技局项目(江科[2014]77号)。

**第一作者：昌水平,男,副主任中药师。Tel：(0750)6621115，E-mail:zyysbk001@126.com。

★昌水平1**张健民1王琦2梁志云1(1.江门市新会区中医院广东 江门 529100；2.江门市药品检验所广东 江门 529000)

摘要：目的：研究蛇伤药酒的质量控制方法。 方法：采用薄层色谱法(TLC)对制剂中大黄进行定性鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)测定盐酸小檗碱的含量，Diamonsil C18(2)色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(32:68)，检测波长为345nm，流速为1.0mL/min，柱温为25℃。 结果：定性鉴别薄层色谱斑点特征明显；高效液相色谱法测定盐酸小檗碱含量，在0.04～0.42μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系，回归方程：Y=0.6156X-0.0776(r=0.9999)，平均加样回收率为99.71%，RSD=1.44%(n=6)。 结论：采用TLC法对大黄定性鉴别，HPLC定量测定盐酸小檗碱含量，两方法简便准确，重复性良好，可有效控制该制剂质量。

关键词：蛇伤药酒；高效液相色谱法；薄层鉴别；盐酸小檗碱

蛇伤药酒是我院已故老蛇医翁东成先生临床治疗蛇伤的验方制剂，由大黄、黄连、五灵脂、吴茱萸、东风菜、金线风等味药材组成，用于治疗各种毒蛇咬伤，蜈蚣、蚊、虫叮咬伤，临床效果良好。为有效控制其质量，本文根据《中国药典》2010年版一部[1]大黄项下薄层鉴别方法、黄连项下含量测定方法，在其基础上，作了适当调整，建立蛇伤药酒的定性、定量检测方法。经实验研究表明，本实验方法简便易行、重现性好，可用于蛇伤药酒的质量控制，现将结果报道如下。

1仪器和试药

1.1仪器戴安U3000高效液相色谱仪(美国)；KQ-500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLER TOLEDO 1/100000天平(瑞士)；数显智能4孔水浴锅(上海康路仪器设备有限公司);Good see-I薄层色谱摄影仪(上海科哲生物科技有限公司);MILLIPORE超纯水器(广州东锐科技有限公司)。

1.2试药大黄对照药材(批号：120984-201202),大黄酚对照品(批号：110796-201319),盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212),三者均购自中国药品生物制品检定所；蛇伤药酒(江门市新会区中医院配制，规格：100mL/瓶，批号：20140512、20140814、201401125)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1大黄薄层鉴别

2.1.1供试品制备取蛇伤药酒50mL，浓缩至约30mL，加盐酸0.5mL，水浴温热数分钟，加三氯甲烷萃取2次(15,10mL)，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇溶解，得供试品溶液。

2.1.2对照品制备取大黄酚对照品2.0mg，加甲醇溶解并定容至2mL容量瓶中，即得对照品溶液。

2.1.3阴性对照品制备取不含大黄药材的蛇伤药酒，以“2.1.1”供试品项下方法制备，得阴性对照溶液。

2.1.4薄层鉴别方法 吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，分别点于硅胶薄层板上，展开剂为石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液[2]，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，结果见图1。

(1-大黄酚对照品；2,3,4-3批供试品溶液；5-大黄对照药材；6-阴性对照)

图1大黄TLC图

2.2盐酸小檗碱含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(2)柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(32:68)；检测波长：345nm；流速：1mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃。

2.2.2溶液的制备

2.2.2.1供试品溶液 精密吸取蛇伤药酒2mL，精密加入盐酸：甲醇(1:100)混合溶液10mL，蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，加在碱性氧化铝柱(100～200目，8g，内径为1cm)上，用甲醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.2.2.2对照品溶液精密称取盐酸小檗碱对照品约10mg，置50mL容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品溶液储备液。精密吸取上述盐酸小檗碱甲醇溶液1mL置20mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为盐酸小檗碱对照品溶液，浓度为10.53μg/mL。

2.2.2.3阴性对照溶液取不含黄连、黄柏药材的蛇伤药酒，以“2.2.2.1”项下方法制备，得阴性对照溶液。

2.2.3系统适应性试验考察在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，测定。结果表明，供试品图谱与对照品图谱在同一保留时间处有相同色谱峰，且光谱图一致，阴性对照无干扰。见图2。

2.2.4线性关系精密量取0.4,0.8,1.0,2.0,4.0mL盐酸小檗碱对照品溶液储备液，分别置于20mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为6.2120，12.4240，24.5300，49.0600，98.1200μg/mL的溶液。分别精密吸取10μL注入HPLC，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，以盐酸小檗碱进样量X为横坐标，峰面积Y积分值为纵坐标，得线性回归方程：Y=0.6156X-0.0776，相关系数r=0.9999。结果表明盐酸小檗碱在0.04～0.42μg范围内与其相应的峰面积值呈良好的线性关系。

2.2.5精密度试验精密吸取“2.2.2.1”项下盐酸小檗碱对照品溶液10μL，按“2.2.1”色谱条件连续进样5次，测定盐酸小檗碱对照品峰面积值的RSD为0.39%，表明精密度良好。

2.2.6溶液稳定性试验精密吸取同一供试品溶液 10μL，注入液相色谱仪，每隔6h测定一次，考察24h，再于48h考察一次。试验结果表明，蛇伤药酒供试品溶液在48h内稳定，供试品中盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.08%(n=6)。

图2　HPLC图谱(A．盐酸小檗碱对照品;B．蛇伤药酒供试品;C．阴性对照)

2.2.7重复性试验精密量取蛇伤药酒2mL，共5份，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，并计算盐酸小檗碱的含量。盐酸小檗碱的平均含量为0.0503mg/mL，RSD为1.43%，说明本方法重复性良好。

2.2.8回收率试验采用加样回收法试验。取已知盐酸小檗碱含量的蛇伤药酒(批号：20140512，盐酸小檗碱的含量为0.0503mg/mL)，精密量取1mL，共6份，分别置10mL量瓶中，分别加入一定量的盐酸小檗碱对照品，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，并计算盐酸小檗碱的含量。计算结果盐酸小檗碱的平均回收率为99.71%，RSD为1.44%。

2.2.9样品含量测定精密吸取20140512,20140814,20141125批次蛇伤药酒2mL，从精密加入盐酸：甲醇(1:100)混合溶液10mL起，按“2.2.2.2”项下处理方法配置，精密吸取供试品溶液与对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，外标法计算样品中盐酸小檗碱的含量，结果见表1。

表1　蛇伤药酒中盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)

3讨论

3.1研究过程中对供试品溶液的制备方法进行了考察，包括提取溶媒、是否通过氧化铝色谱柱净化，以及洗脱溶剂的种类和体积数量，结果显示，以“2.2.2.2”项下方法制得的供试品溶液色谱杂峰较少，分离效果好，完全满足药典定量分析的要求。

3.2根据《中国药典》2010版一部“黄连”含量测定项下流动相条件进行调整，选用乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(32:68)为流动相对本品进行试验，所得色谱图的分离度好，保留时间适宜。

3.3试验结果表明，薄层色谱法鉴定大黄斑点清晰，且阴性对照无干扰；高效液相色谱法测定盐酸小檗碱含量，其精密度RSD为1.08%(n=5)；稳定性RSD为1.08%(n=6)；重复性RSD为1.43%(n=5)；加样平均回收率为99.71%，RSD为1.44%(n=6)，均能满足定量的要求。故本方法可用于蛇伤药酒的质量控制。

参考文献

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010:22,285.

[2]林子安，昌水平, 刘庭恩,等.拔毒消炎软膏质量控制研究[J].蛇志，2014.26(2): 153-155.

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TLC Identification and Determination of Berberine Hydrochloride by HPLC in Sheshang Medicinal Liquor

CHANG Shui-ping1，ZHANG Jian-min1，WANG Qi2，LIANG Zhi-yun1

1.JiangmenXinhuiHospitalofTraditionalChineseMedicine，Jiangmen529100，China；

2.JiangmenInstituteforDrugControl，Jiangmen529000，China.

Abstract:Objective:To study the method of quality control for Sheshang medicinal liquor. Methods: The thin layer chromatography(TLC) was used to the qualitative identification of rheum officinale; the quantitative analysis of berberine hydrochloride was carried out by HPLC with a Diamonsil C18(2) chromatograhpic column(200mm×4.6mm，5μm),the mobile phase was acetonitrile - 0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (32:68) with the flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength of 345nm,the temperature of column was 25℃. Results:The characteristic of TLC spots was obvious in the qualitative identification. HPLC determind the content.The berberine hydrochloride in 0.04～0.42μg extent show good linear ralation,and the regression equation was Y=0.6156X-0.0776，(r=0.9999) with an average recovery rate of 99.71%(RSD=1.44%, n=6). Conclusion:The methods of using TLC and HPLC are simple and accurate, and can be used for the quality control of Sheshang medicinal liquor.

Key words:Sheshang Medicinal Liquor; HPLC; TLC;Berberine Hydrochloride;Methodology

收稿日期：(2015-06-02)编辑：曾文雪

中图分类号：R286.0

文献标识码：B