建立一种测定毛发中THC和THCC的LC/MS/MS分析方法

建立一种测定毛发中THC和THCC的LC/MS/MS分析方法

★韩方*(浙江中医药大学杭州 310053)

摘要：目的：建立一种大麻活性成分△9-四氢大麻酚﹙THC﹚及其主要代谢物△9-氘代四氢大麻酚﹙THCC﹚的液相色谱-串联质谱-多反应监测(LC-MS/MS-MRM)分析方法。方法：毛发经去污处理后，甲醇萃取分离、纯化，采用LC-MS/MS法分析，用正负离子切换模式进行THC与THCC的定量分析。结果：该方法对THC与THCC的线性范围为1～20 ng/mg﹙r>0.997﹚，检测限分别为0.5 ng/mg 和0.25 ng/mg，定量限分别为1ng/mg与0.5 ng/mg。日内和日间的精密度分别为1.2%～8.8%和1.9%～9.5%，准确度为86.9%～113.1%。结论：建立的LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、准确、可靠，适用于毛发中大麻活性物质及其代谢产物的定量测定。

关键词：毛发；THC；THCC；LC-MS/MS

大麻作为世界上最广泛滥用的毒品，主要作用于神经系统，具有强烈的成瘫性和麻醉性，使人的神经由兴奋转为抑制。大麻中主要起精神活性作用的是△9-四氢大麻酚(THC)，进入体内后，在肝脏和其他组织中代谢成 △9-11-羟基-四氢大麻酚(11-OH-THC)，继而代谢成△9-四氢大麻酸(THCC)。对已超过尿、血检测时限或需要判断是偶尔吸食还是长期滥用毒品的情况，可取毛发作为检测样本[1]。液相色谱串联质谱﹙LC/MS/MS﹚因具有较短的分析时间、较高的检测感度及较高的选择性，而被越来越多的用于实验室常规分析。从THC与THCC的化学结构推论，THC使用正离子检测模式应可得到较佳的感度，而THCC具有羧基应适合使用负离子检测模式[2-3]，本研究目的在于采用正负离子切换模式LC/MS/MS分析方法对THC与THCC同时进行检测[4]。

1仪器与材料

1.1仪器ACQUITY超高效能液相色谱仪(美国Waters Corporation)，API 2000型三重四级杆串联质谱仪(美国Applied Biosystems)，PipetmanUlttra微量吸取器(美国Gilson, Inc.)，SevenEasyS20酸碱值测定仪(瑞士Mettler-Toledo International Inc)。

1.2试药△9-四氢大麻酚(THC)(美国Cerilliant公司)；△9-氘代四氢大麻酚(THC-D3)(美国Cerilliant公司)；△9-四氢大麻酸(THCC)(美国Cerilliant公司)；△9-氘代四氢大麻酸(THCC-D9)(美国Cerilliant公司)；甲醇、乙腈、乙酸、二氯甲烷、甲酸均为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1色谱和质谱条件色谱柱：Chromolith Performance RP-18e﹙3.0 × 100 mm, Merck, Darmstadt，德国﹚，保护柱：Phenomenex Security Guardkit﹙2.0 × 4 mm ×3.5 mm, Phenomenex, Torrance CA，美国﹚，流动相：甲醇-10 mmol/L 乙酸铵﹙pH=4.0﹚﹙9:1﹚，流速：0.4 mL/min，进样体积：30μL，柱温：室温。

离子源：电喷雾电离源(ESI)，正离子模式：选择多反应检测扫描(MRM)模式，喷雾电压5500V；干燥气温度450℃，干燥气体流量10 μL/min；雾化气(gas 1)20Psi；辅助气(gas 2)50psi；帘气(CUR)30psi；碰撞气压力为2；去簇电压(DP)25V；碰撞能量(CE)均为30 eV；用于定量分析的离子反应分别为m/z 315.2→m/z 193.2(THC)和m/z 318.2→m/z 196.2(THC-D3)。负离子模式：选择多反应检测扫描(MRM)模式，喷雾电压-4500V，去簇电压(DP)-45V；碰撞能量(CE)为-26 eV；用于定量分析的离子反应分别为m/z 343.2→m/z 299.1(THCC)和m/z 352.0→m/z 308.1(THCC-D9)，其它条件同正离子模式。

2.2溶液制备对照品溶液的制备：分别取100μg/mL的THC和THCC溶液各1.0ml置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密量取上述溶液1.0mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

内标溶液的制备：分别取100μg/mL的THC-D3与THCC-D9溶液1.0mL置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密量取上述溶液1.0mL置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

2.3分析方法的验证

2.3.1专属性取空白毛发样品，置于玻璃样品瓶中，用二氯甲烷震荡洗涤2次，40℃烘干后剪成约0.2cm的碎段，置于冷冻粉碎机内粉碎，精密称取粉碎后的头发样品粉末20mg，置于玻璃样品管中，精密量取1mL甲醇至样品管中，于40℃下超声震荡3h，用1mL 塑料针筒取出甲醇萃取液，过0.45μm铁氟龙针头滤膜，制得空白毛发溶液。同法，加入100μL 内标溶液和100μL对照溶液，加入甲醇至总体积1mL，经3h超声震荡萃取，过滤，制成含THC，THC-D3，THCC和THCC-D9的空白毛发溶液，检测结果表明空白毛发中的基质对THC、THCC及其内标的检测无干扰，如图1和图2所示，表明该方法的专属性良好。

图1　空白毛发溶液

2.3.2线性关系分别称取20 mg的空白毛发粉末置于样品瓶中，加入含THC和THCC均为1μg/mL的甲醇溶液20、40、50、100、200及400μL，再加入1μg/mL的THC-D3与THCC-D9甲醇溶液100μL，最后加入甲醇至总体积1 mL，经3h超声震荡萃取，过滤，制成含THC和THCC浓度均为1、2、2.5、5、10及20 ng/mg的毛发样品。以LC/MS/MS进行测定，计算测得结果中各分析物峰面积与内标峰面积之比值，并与配制浓度以1/x 权重方式建立工作曲线。THC及THCC回归方程,见表1。

图2　加入THC，THC-D3，THCC和THCC-D9的空白毛发溶液

药品名称线性范围(ng·mg-1)线性方程rTHC1～20y=0.155x+0.03540r=0.9970THCC1～20y=0.236x+0.00885r=0.9999

2.3.3准确度与精确度取空白毛发样品溶液，经重复试验后，计算各测量浓度平均值、标准偏差及相对标准偏差，评估日内﹙intra-day﹚或日间﹙inter-day﹚准确度与精密度。

THC与THCC日内准确度为88.8%～113.1%；而日内精密度以相对标准偏差表示为1.2%～8.8%，如表2所示。

表2　THC与THCC毛发检验方法的日内准确度与精密度

THC与THCC日间准确度为86.9%至101.5%；而日间精密度以相对标准偏差表示为1.9%至9.5%，如表3所示。

表3　THC与THCC毛发检验方法的日间准确度与精密度

2.3.4检测限以信噪比S/N≥3：1计，测得THC与THCC的LOD分别为0.5 ng/mg与0.25 ng/mg。

2.3.5定量限以信噪比S/N≥10：1计，测得THC与THCC的LOQ分别为1ng/mg与0.5 ng/mg。

3讨论

本研究建立的毛发中THC与THCC检验方法成功将正负离子切换模式应用于分析方法的中，并通过对色谱条件进行优化，使此检验方法可在5 min内同时完成检测THC与THCC的含量。

因毛发中并没有可以将药物代谢的酶，所以进入毛发的药物在未修剪头发的情况下，可稳定地保存服用药物的历程。在法医科学的领域中，毛发的检验常用于证明习惯性的药物滥用或其药物滥用的历史[5]。因为毛发暴露于吸食大麻时产生的烟雾中，也可能会导致毛发检验检出的THC为阳性，为了避免伪阳性检验结果的发生，有必要同时开发毛发中THCC准确可靠的分析方法。毛发检验一般可检验出一星期至几个月间之用药情况，本方法弥补了目前大麻滥用检测的常用方法尿液、血液检验的不足。可以很好对下述两种的鉴定：1. 已超过尿、血检测时限；2.需要判断是偶尔吸食还是长期滥用毒品。本研究建立的液相色谱串联质谱分析方法，经实验证明快速、灵敏、准确、可靠地检验人体毛发中THC与THCC含量，可有效避免假阳性结果。

参考文献

[1]Laloup M, del Mar Ramirez Fernandez M, De Boeck G, et al. Validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of 26 benzodiazepines and metabolites, zolpidem and zopiclone, in blood, urine, and hair[J].J Anal Toxicol. 2005; 29:616-26.

[2]Moore C, Guzaldo F，Donahue T. The determination of 11-nor-△9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid (THC-COOH) in hair using negative ion gas chromatography-mass spectrometry and high-volume injection[J].J Anal Toxicol. 2001; 25:555-8.

[3]Marsili R, Martello S, Felli M, et al. Hair testing for △9-THC-COOH by gas chromatography/tandem mass spectrometry in negative chemical ionization mode[J].Rapid Commun Mass Spectrom. 2005; 19:1566-8.

[4]Wen B, Ma L, Nelson SD, et al. High-throughput screening and characterization of reactive metabolites using polarity switching of hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry[J].Anal Chem. 2008; 80:1788-99.

[5]Nishida K, Itoh S, Inoue N, et al. High-performance liquid chromatographic-mass spectrometric determination of methamphetamine and amphetamine enantiomers, desmethylselegiline and selegiline, in hair samples of long-term methamphetamine abusers or selegiline users[J].J Anal Toxicol. 2006; 30:232-7.

A Method for Simultaneous Determination of THC and THCC in Human Hair by LC/MS/MS

HAN Fang

ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) method in multiple reaction monitoring (MRM) mode was developed and validated for the simultaneous determination of △9-tetrahydrocannabinol (THC) and 11-nor-9-carboxy-△9-tetrahydrocannabinol (THCC) in human hair. Methods: Hair samples after decontamination,was extracted by methylene, purified. LC/MS/MS analysis with polarity switching was then performed to quantitate THC and THCC. Results: The linear range was 1～20 ng/mg (r>0.997).The limit of detection were 0.5 ng/mg and 0.25 ng/mg for THC and THCC. The limit of quantification were 1 ng/mg and 0.5 ng/mg, respectively. The relative standard deviations of intra and inter-day precisions were 1.2%～8.8% and 1.9%～9.5%, respectively. The inter-day accuracy ranged from 86.9%～113.1%. Conclusion: The result showed that the method was rapid, sensitive and accurate, and was applicable in the quantitative determination of THC and THCC in human hair.

Key words:Human Hair;THC;THCC;LC/MS/MS

收稿日期：(2015-06-29)编辑：翟兴英

中图分类号：R284.1

文献标识码：B

作者简介：*韩方(1972—)，男，硕士研究生。研究方向：中药学。Tel: 13583280360，E-mail: 13583280360@139.com。