调节性树突状细胞与移植免疫耐受的研究进展

叶鹏程，向琴，肖江卫

(川北医学院附属医院，四川南充 637000)

自1973年斯坦曼和科恩发现树突状细胞(dendritic cells，DCs)以来，人们逐渐认识到DCs在调控先天性和适应性免疫反应中扮演着重要的角色，能够恰到好处地将外源性病原信号传递给淋巴细胞并启动与之相适应的免疫反应。近年来的研究表明DCs是一群具有明显异质性的细胞群体，不同成熟状态、不同组织来源及不同的细胞亚群的DCs表现出不同的表型及产生不同的细胞因子并诱导不同的免疫反应。其中，调节性树突状细胞(regulatory dendritic cells，DCreg)则是一群具有负向免疫调控功能亚群，其功能特点与作用机制的研究是该领域近年来的重要进展之一。器官移植是治疗终末期细胞或器官功能衰竭首选的、有效的治疗手段。迄今已有许多成功的先例，然而免疫排斥反应严重地制约着该项治疗措施的广泛开展，虽然抑制免疫排斥反应的新药不断问世，但除了经济负担外，药物本身的副作用也给患者带来了十分不利的影响。因此，人们致力于寻找一种在不使用免疫抑制剂的情况下保证移植物的长期有功能地存活的有效方法，利用DCreg介导负向免疫调节的特性诱导机体产生移植免疫耐受便是其中一种。随着对其功能及作用机制的不断认识，DCreg在诱导实验动物移植免疫耐受的实验中已取得一定成功，这为解决移植排斥反应打开了另一扇新的大门。

1 DC与DCreg的生物学特性

DC是一群复杂的血源性细胞，多起源于骨髓，其前体细胞为CD34+造血干细胞，经骨髓进入循环系统。人体中DC数量极少，其含量不足外周血中单核细胞的1%。之前的观点认为DCs分布于除脑以外的全身组织器官中，后来研究显示在胸腺、次级淋巴组织以及外周组织，如皮肤、黏膜表面、小肠、肺及母体子宫蜕膜中都发现了 DCs［1］。Li等［2］还在小鼠模型的大脑中分离出大量的CD11b+CD11c+DCs，这种DCs能促进调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的增殖，从而抑制免疫应答，此发现刷新了人们对DCs组织分布的认识。

DCs根据分化来源不同主要分为两种，即“经典”髓系 DCs(“conventional”myeloid DC，cDC)和浆细胞DCs(plasmacytoid DC，pDC)，研究发现cDC与pDC无论在表面标志还是功能上均存在着一定的差异［3-4］。pDC仅为DCs中一个小的亚群，主要聚积于血液和淋巴组织中，通过血液循环进入淋巴结。pDC的表型为CD4+CD112+CD132+CD332+CD45RA+IL23Rα(CD123+)，低水平表达 MHC-Ⅱ分子及共刺激分子，同时他们也表达窄范围的识别模式受体(PRRS)，包括TCR7和TCR9。在负载外源性核酸时他们还能产生大量的I型IFN，同时获得抵抗外源性抗原的能力［5］。cDC是除pDC之外的DC，填充于大多数淋巴组织和非淋巴组织中，cDC前体细胞在GM-CSF、TNF-a和IL-4作用下转变为未成熟 DC(immature DC，imDC)，再经 CD40L或内毒素刺激而成熟，其表型为 CD11c+CD13+CD33+GM-CSF2Rα+CD42+。cDC具有强大的监视组织损伤，捕获环境中的抗原，处理并提呈致病性抗原的能力。此外cDC还能产生强大的抗外源性抗原的免疫力，也能通过多种机制对自身抗原产生免疫耐受［6-7］。

DCs是一群异质性细胞，不同的发育阶段及不同来源的DCs在表面特异性标志及功能上均存在着差异。成熟的DC(mature DC，mDC)表达高水平的MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子，能够诱导T细胞分化成为具有独特细胞因子分泌性的效应T细胞。然而体内大部分的DCs都处于未成熟状态，与mDC相比imDC低水平表达MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子，也表达趋化因子受体(CCR7)，具有极强的抗原吞噬力［8］。imDC虽然仅有较弱的活化T细胞的能力，但能抑制细胞因子的分泌，诱导免疫耐受［9］。

O’Connell等［10］通过静脉输注 imDC 观察它对同种异体小鼠心脏移植物存活时间的影响，发现imDC能够明显延长移植物存活时间。此外Fu等［11］和 Lu 等［12］通过研究 imDC(CD205+，MHC-Ⅱ，CD40dimCD80dimCD86dim)与大鼠同种异体心脏移植物存活时间的关系，提出imDC具有强大的免疫耐受性，能够诱导移植免疫耐受。鉴于imDC具有较弱的活化T细胞的能力，并能诱导Treg的增殖以诱导免疫耐受，早期部分学者便认为imDC就是DCreg的原型。

DCreg被认为是一群具有强大的免疫抑制功能的DCs已不再是一件新奇的事情，然而迄今为止人们对DCreg的生物学特性的认识仍存在一定的争议。之前认为DCreg表达高水平的MHC分子及极低水平表达共刺激分子，诱导CD4+和CD8+的Treg细胞的产生与增殖，进而预防移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)或诱导同种异体肾移植免疫耐受［13-14］，然而后来的研究发现其高水平表达CD80、CD86等共刺激分子，具有IL-10分泌性的DCreg依然能诱导CD4+Treg的产生［15］。Isomura等［16］研究发现DCreg不但高水平表达MHC分子及共刺激分子，同时还表达B7-H1、B7-DC和B7-H3分子，能够阻断DTH的诱导通路。此外还有报道称DCreg表达低水平的MHC-Ⅱ、CD86和 CD11c，高水平表达CD80、CD40和CD11b，能分泌IL-10和NO，且能活化幼稚T细胞，但不能产生IL-12和TGF-β，也不能诱导CD4+T细胞分化为Treg细胞。因此对于DCreg特异性表面标志物仍还存在很大争议，但DCreg的免疫耐受性或免疫调节功能在移植免疫耐受、过敏反应、自身免疫性疾病中起重要的作用这一结论已被反复验证［17］。

2 DCreg与移植免疫耐受

细胞或器官移植是治疗终末期细胞或器官功能衰竭的有效的、首选的治疗手段。迄今已有很多成功的先例，然而细胞或器官移植仍严重受限于供体短缺及免疫排斥反应。虽然抑制免疫排斥反应的新药不断问世，但仍存在较多的毒副作用［18］。

DCreg具有负性免疫调节功能，能够通过多种机制诱导免疫耐受，因此DCreg可以为器官移植免疫排斥反应的治疗提供新的思路，而这一思路在动物移植模型中已得到较为成熟的应用。朱杰昌等［19］等给心脏移植术后的小鼠输注以针对小鼠CIM0基因的RNA干扰(RNA interference，RNAi)慢病毒载体在体外感染供者骨髓来源的DC制备的低表达CD40的耐受性DCreg，可以诱导移植免疫耐受从而延长小鼠移植心脏的存活时间。Ezzelarab等在一个恒河猴同种异体肾移植模型中发现，供体血液来源的单核细胞经 VD3，IL-10，GM-CSF及 IL-4刺激后分化为低水平表达MHC-Ⅱ分子及共刺激分子，较高水平表达B7-H1的DCreg。于肾移植前7 d连同B7-CD28阻断剂CTLA-4Ig一起将DCreg经静脉输入受体后能明显延长移植物的存活时间(对照组平均存活时间39.5 d，实验组平均存活时间113.5 d)。通过免疫监视发现，经DCreg治疗的受体内出现了与供体相关的记忆T细胞，且Treg/记忆T细胞的比率呈逐渐下降的趋势，这与DCreg具有较高的促进CD95记忆T细胞凋亡以及较弱活化同种异体T细胞能力相关。此外该实验还证实了DCreg与共刺激分子阻断剂联合使用能够诱导移植免疫耐受，且能提高肾移植存活率［20］。Huang 等［21］在MHC分子不完全匹配的造血干细胞移植模型中发现，表型为CD8α+Jagged2highCD11bhigh的DCreg能降低GVHD的症状，延缓GVHD模型的死亡，这主要与DCreg上调Jagged1、Jagged2表达以及激活T细胞Notch信号通路相关，但延长的时间不是太长，且需要反复多次的注射。

3 DCreg诱导免疫耐受的机制

3.1 DCreg本身不能有效地活化效应T细胞

一般而言，T细胞在介导移植细胞、组织或器官破坏的免疫反应中起着最为核心的作用，同时在控制这些对机体或移植物有害的反应也起着至关重要的作用［22］。然而T细胞在接受抗原刺激后完全活化依赖于双信号的刺激及相应的细胞因子，DCreg通常极低水平表达共刺激分子，而CD40、B7等共刺激分子又是T细胞活化所必须的第二信号，因此DCreg无法活化T细胞而导致T细胞“无能”或低反应性，从而诱导抗原特异性的免疫耐受［23］。

3.2 DCreg能够诱导Th1型或Th2型应答的偏移

在移植免疫中，Th1反应常介导明显的急性排斥反应从而使移植物丧失功能，而Th2反应则常参与免疫耐受。被活化的Th0分化为Th1或Th2细胞，分别介导Thl或Th2反应。近年研究发现，DCs是控制Th0细胞分化成Th1或Th2细胞的关键因素。DCreg能够通过诱导Th2反应使得机体对移植物或外来抗原发生免疫耐受［24］。Gorczynski等［25］发现经门静脉注射DCreg可以延长同种异体皮肤移植物的存活时间，这可能与分泌 IL-4和 IL-10的Th2细胞分化相关。

3.3 DCreg能有效地诱导调节性T细胞的产生

DCreg除了能够诱导T细胞“无能”或促进T细胞清除外，还能诱导Treg细胞的产生，这是DCreg诱导免疫耐受最为重要的机制。Jonuleit等［26］在研究不同成熟状态的DCs对T细胞的分化发育的作用的实验中，将人CD83-DC与CD83+DC分别与幼稚的同源异体T细胞培养，结果发现将mDC反复刺激CD4+幼稚T细胞，能明显地促进T细胞的增殖，然而将imDC反复刺激T细胞却表现出不可逆的抑制T细胞增殖的特性，这种抑制在经mDC、外周单核细胞及IL-2的作用下均无法恢复。在后来的研究中证实imDC能够促幼稚T淋巴细胞分化为具有IL-10分泌性的T细胞，同时高水平表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(英文名称，CTLA-4)和CD25，体外实验还发现该群T细胞能够抑制T淋巴细胞增殖，具有 Treg 细胞的特性［27］。Fallarino 等［28］发现经CD3抗体活化的CD4+CD25+Treg过度表达CTLA4，同时调控DC表达吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine-2，3-dioxyge-nase，IDO)，而这种结果需要DC表达B7及IFN-γ。此外在这同一研究中CD4+CD25+Treg经LPS活化后通过CTLA-4诱导DC细胞内色氨酸的分解代谢，从而引起T细胞增殖必需的色氨酸缺乏而抑制T细胞应答。Martín-Gayo等［29］发现人类胸腺中的pDC经CD40L及IL-3激活后能够有效地促进历经胸腺阳性选择表型为CD69highTCRhigh的CD4+CD8+胸腺细胞分化为具有免疫抑制功能的CD4+CD25+Foxp3+Treg。与mDC相比，成熟的pDC增加了ICOS-L的表达，这与诱导具有IL-10分泌的Treg相关。他们还发现在大鼠体内，pDC能够通过上调IDO的表达来下调T细胞的反应性［30］。Chu等［31］在皮肤的真皮层中发现一种具有免疫调节功能及IL-10分泌性的CD141(BDCA3)+DC，能够交叉递呈自身抗原给自身反应性T细胞。此外还发现CD141(BDCA3)+DC具有强大的诱导Treg的发生能力，从而抑制皮肤炎症反应。

Fehervari等［32］发现当 DCs暴露于抗炎细胞因子或免疫抑制分子中会促使DC表现出免疫抑制的特性［33］，例如体外培养的DCs中加入抗炎因子如维生素 A、维生素 D3、PGE2、IDO、IL-10、TGF-β、HGF后能够表现出免疫耐受性［34-36］，这些具有免疫耐受性的DCs能够诱导Treg的产生，并能抑制动物模型建立的自身免疫性疾病，如1型糖尿病和多发性硬化症。此外，这些DCs通过基因操纵过度表达免疫调节分子或免疫抑制因子，沉默免疫活化因子促进免疫耐受［37］。

体外实验中发现DCreg具有调控免疫抑制反应和促进 Treg分化与增殖的能力，同时还发现在DCreg与Treg之间存在一个“反馈调节”环，两者之间通过反馈调节环相互作用，在机体免疫平衡的状态下减少Treg，DCreg细胞内Flt3活性则会上调，进而促进Treg稳定增殖;相反，当增加DCs时会通过DC细胞表面MHC-Ⅱ分子的积累来促进Treg细胞的分裂。

Treg细胞是一类具有免疫抑制功能，专职对免疫应答进行调控的异质性T淋巴细胞亚群，它与自身耐受、移植物耐受和肿瘤的逃逸等有密切关系［38］。Sakaguchi等证实，体内剔除受体小鼠CD4+CD25+Treg会增强移植免疫排斥反应，明显降低移植物的存活时间。然而给免疫力重建的小鼠回输同系CD4+CD25+Treg则能显著地延长移植物的存活时间，这表明CD4+CD25+Treg细胞参与了移植免疫耐受的诱导。Dong等［39］为了明确CD4+Treg的异质性，利用多参数单细胞分析技术分析 CD4+Treg，分析发现与普通患者相比严重缺乏幼稚表型的Treg的患者在行同种异体造血干细胞移植后短期内会表现出急性GVHD。Li等［40］通过心脏移植动物模型研究CD8+Treg对经CD40Ig处理过后的小鼠心脏移植物的影响，发现CD8+Treg能明显延长移植物的存活时间。此外还发现CD8+的Treg细胞及pDCs聚集于同种异体移植物及受体的脾脏，但不聚集于淋巴结内，这可能与血管移植受体所诱导的免疫耐受相关。

3.4 促使抗原特异性的T细胞的凋亡

Fas稳定表达于胸腺细胞及成熟的T细胞，参与胸腺的阴性选择及识别自身抗原的T细胞的克隆清除。表达FasL的DCreg通过Fas-FasL作用诱导活化了的抗原特异性的T细胞的凋亡。小鼠骨髓来源的DC经GM-CSF及IL-4共同孵育可表达FasL，以计量依赖方式诱导抗原特异性T细胞的凋亡［41］。

3.5 参与DCreg诱导免疫耐受的重要的细胞因子

(1)IL-10:IL-10主要通过减少MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子及细胞黏附分子等抑制DC的成熟，还能减少炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-12等的合成，进而抑制T细胞活化及增殖。(2)转化生长因子β(TGF-β):Ramalingam 等［42］发现经 TGF-β 诱导后，DC表面共刺激分子、MHC类分子表达下降，并明显抑制了混合淋巴细胞反应中同种异体T细胞增殖，说明TGF-β可以降低DCs的成熟状态，从而抑制T细胞活化、增殖。(3)一氧化氮(NO):DCreg在暴露于血清蛋白、自身循环蛋白时，可表达高水平的诱导性的一氧化氮合酶，促进NO的生成。NO作为一类重要的细胞信号分子，既能激活初始T细胞，也能抑制T细胞的增殖，诱导免疫耐受。(4)IDO:吲哚胺2，3-双加氧酶是色氨酸分解的限速酶，而色氨酸是T淋巴细胞尤其是抗原活化了的T细胞增殖所必需的氨基酸。因此，DCreg细胞高水平表达吲哚胺2，3一双加氧酶将促进色氨酸分解代谢，加快色氨酸的耗竭，能很大程度上抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖，从而诱导免疫耐［43-44］。

虽然DCreg能够通过上述多种机制诱导免疫耐受，并在一定程度上延长移植物的存活时间，但其诱导的移植免疫耐受常不稳定，容易被逆转。因此，怎样才能诱导出持续恒定的免疫耐受仍是亟待解决的问题。就目前的研究现状而言，多数实验采用单一方式即仅通过静脉输注体外培养的DCreg以诱导免疫耐受，在强度以及持续时间上都存在一定的不足。能否通过联合使用免疫抑制剂或共刺激分子阻滞剂或其他方式来诱导、维持更长效更强的免疫耐受?这值得我们进一步深入研究探讨。

4 小结

综上所述，DCreg是一群具有负性免疫调节的DC，能够诱导实验动物模型免疫耐受，延长移植物的存活时间，改善GVHD的症状。DCreg诱导免疫耐受主要通过以下方式:(1)减少效应T细胞的活化;(2)诱导Treg细胞的产生;(3)促使抗原特异性T细胞的凋亡，其中诱导Treg细胞的产生是DCreg诱导免疫耐受最为重要的机制。随着对DCreg研究的不断深入，其在移植免疫耐受、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病及肿瘤等疾病的发病和治疗的研究中可作为新的靶点发挥重要作用。因此，如何利用DCreg诱导强效、持续、稳定的免疫耐受将是我们亟需解决的问题。

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