人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制

陈艳霞，杨丽萍，吴险峰，秦晓华，黄 翀，房向东，涂卫平



·论著·

人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制

陈艳霞，杨丽萍，吴险峰，秦晓华，黄 翀，房向东，涂卫平

目的 探讨重组人红细胞生成素(rhEPO)对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)转分化过程中炎性因子的变化及其可能机制。方法 体外培养HK-2细胞，采用随机数字表法分为空白对照组(未加任何刺激物)、高糖诱导组(高糖终浓度为30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇为24.5 mmol/L)、rhEPO对照组(rhEPO终浓度为20 U/ml)、不同浓度rhEPO干预组(rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/ml+高糖)及Rho激酶抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为30 μmol/L，加入Y27632 30 min后加高糖，高糖终浓度为30 mmol/L)，以上各组均培养24 h。采用RT-PCR检测各组细胞RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平；采用细胞免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平；采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人纤维连接蛋白(FN)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平。结果 各组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中高糖诱导组与5 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均高于空白对照组，10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组及Rho激酶抑制剂组RhoA、ROCK1 mRNA表达均低于空白对照组(P<0.05)；不同浓度rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于高糖诱导组(P<0.05)，Rho激酶抑制剂组ROCK1 mRNA表达低于高糖诱导组(P<0.05)；10 U/ml rhEPO组与20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于5 U/ml rhEPO组(P<0.05)；20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于10 U/ml rhEPO组(P<0.05)。各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中高糖诱导组、不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均高于空白对照组，E-cadherin均低于空白对照组(P<0.05)；不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于高糖诱导组，E-cadherin均高于高糖诱导组(P<0.05)；10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组(P<0.05)；Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组(P<0.05)；20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO组(P<0.05)；Rho激酶抑制剂组α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组(P<0.05)。Pearson直线相关结果分析，高糖诱导组、不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.885、0.901、0.886、0.868，P<0.05)。结论 rhEPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化，rhEPO还可以通过减少炎性因子的产生，减轻炎性反应，从而延缓糖尿病肾病(DN)的进展，延缓肾间质纤维化，其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。

糖尿病肾病；红细胞生成素；细胞转分化；白细胞介素6；肿瘤坏死因子α；RhoA/ROCK信号通路

陈艳霞，杨丽萍，吴险峰，等.人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制[J].中国全科医学，2015，18(20)：2433-2438.[www.chinagp.net]

Chen YX,Yang LP,Wu XF，et al.Effect and possible mechanism of rhEPO in the transdifferentiation of human kidney proximal tubular epithelial cells induced by high glucose and the changes of inflammatory cytokines[J].Chinese General Practice，2015，18(20)：2433-2438.

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病全身微血管病变的一部分，是糖尿病的严重慢性并发症，已成为终末期肾病的重要原因。DN发病的分子机制主要包括多元醇通路的激活、蛋白激酶C(PKC)通路的激活、晚期糖基化终末产物的形成、炎性反应、氧化应激、肾素血管紧张素-醛固酮系统的激活。高血糖是引起DN的始动因素，使用控制血糖的药物可以帮助调节血糖水平从而保护肾功能，进而延缓肾衰竭，但这也不能完全阻止DN的进展，因此，寻找新的药物阻止DN的进展以及治疗非常必要。目前DN的发病机制尚不完全清楚。越来越多的证据支持炎症是DN的发病机制之一，慢性微炎症状态及免疫系统的激活在DN的发生发展中发挥着不可或缺的作用[1-2]。白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)在DN的发生发展过程中发挥重要作用。人红细胞生成素(rhEPO)主要由肾皮质Ⅰ型间质细胞合成，具有潜在的组织和细胞保护作用，本实验选取高糖诱导HK-2细胞模拟DN，并探讨rhEPO对高糖诱导的HK-2细胞转分化的作用，及其过程中炎性因子的变化，为延缓DN肾纤维化的进展寻找新的证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 rhEPO(沈阳三生制药股份有限公司惠赠)，DMEM/F12培养基(美国Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)，高糖，甘露醇，Rho激酶抑制剂Y27632(美国Sigma)，RNA抽提试剂Trizol(美国Invitrogen)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金)，聚合酶链反应引物由Invitrogen合成，鼠抗人单克隆α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、鼠抗人单克隆E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、FITC标记抗小鼠IgG(北京中杉金桥)，人纤维连接蛋白(FN)、IL-6、TNF-α定量酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海森雄)。

1.2 主要仪器 核酸微量蛋白测定仪、PCR扩增仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad)，DYPC-31DN型电泳仪(北京市六一仪器厂)，荧光显微镜(日本Olym-pus)，酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 HK-2细胞培养及实验分组 HK-2细胞株来源于美国ATCC细胞库，由中山大学附属第一医院余学清教授惠赠。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养HK-2细胞，细胞生长至70%～80%融合时传代入6孔培养板中继续培养，至80%融合后改用无血清DMEM/F12培养基同步24 h。采用随机数字表法分组：空白对照组(未加任何刺激物)、高糖诱导组(高糖终浓度为30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇24.5 mmol/L)、rhEPO对照组(rhEPO终浓度为20 U/ml)、不同浓度rhEPO干预组(rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/ml+高糖，高糖终浓度为30 mmol/L)及Rho激酶抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为30 μmol/L，加入Y27632 30 min后加高糖，高糖终浓度为30 mmol/L)，以上各组均培养24 h。实验重复3次。

1.4 RT-PCR检测 加入干预后培养24 h收集细胞，用Trizol分别提取各组细胞总RNA，检测RNA完整性后用核酸微量蛋白测定仪测定RNA浓度。取总RNA 1.5 μg进行反转录合成cDNA，取cDNA 2 μl在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下扩增目标基因(以人β-actin为内参照)，总反应体系为50 μl。RhoA引物序列：正义链5′-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3′，反义链5′-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3′，扩增产物356 bp。ROCK1引物序列：正义链5′-TGATGGCTATTATGGACGAG-3′，反义链5′-GGAGCGTTTCCCAAGC-3′，扩增产物293 bp。β-actin引物序列：正义链5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反义链5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，扩增产物434 bp。反应条件：94 ℃预变性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35个循环。配制2%琼脂糖凝胶，PCR产物电泳仪内120 V，30 min完成电泳后应用凝胶成像系统成像并使用Quantity One软件进行数据分析。

1.5 细胞免疫荧光 6孔培养板中的细胞用4%多聚甲醛固定20 min(放4 ℃冰箱)，用0.1% Triton穿孔15 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封闭液室温封闭30 min后，各孔中滴加鼠抗人单克隆α-SMA抗体(抗体按1∶200稀释，5% BSA封闭液配制)或鼠抗人单克隆E-cadherin抗体4 ℃冰箱孵育过夜后取出，室温恢复30 min，加入FITC标记抗小鼠IgG二抗置37 ℃孵箱孵育30 min，荧光显微镜下观察。每组细胞随机选取10个视野摄像，荧光图片用Image-Pro Plus 6.0软件分析，每个视野累计光密度值与测量面积的比值为平均荧光强度(即蛋白相对表达量)。

1.6 ELISA法检测FN、IL-6、TNF-α蛋白的表达 收集细胞上清液后，严格按照ELISA试剂盒说明进行操作，读取波长为450 nm时OD值，绘制标准曲线，根据标准曲线方程分别求出样品FN、IL-6、TNF-α蛋白表达浓度。

2 结果

2.1 高糖、rhEPO对RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达的影响 各组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中高糖诱导组与5U/mlrhEPO组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达均高于空白对照组，10U/mlrhEPO组、20U/mlrhEPO组及Rho激酶抑制剂组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达均低于空白对照组；5U/mlrhEPO组、10U/mlrhEPO组及20U/mlrhEPO组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达均低于高糖诱导组，Rho激酶抑制剂组ROCK1mRNA表达低于高糖诱导组；10U/mlrhEPO组及20U/mlrhEPO组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达均低于5U/mlrhEPO组，Rho激酶抑制剂组RhoAmRNA高于5U/mlrhEPO组，ROCK1mRNA表达低于5U/mlrhEPO组，差异均有统计学意义(P<0.05)；20U/mlrhEPO组RhoAmRNA、ROCK1mRNA表达均低于10U/mlrhEPO组，Rho激酶抑制剂组RhoAmRNA高于10U/mlrhEPO组，ROCK1mRNA表达低于10U/mlrhEPO组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1ComparisonofthemRNAlevelsofRhoAandROCK1amongallthegroups

组别株数RhoAmRNAROCK1mRNA空白对照组309446±0131510074±00020高糖诱导组314003±00217a19130±00109a甘露醇对照组309515±0003810033±00019rhEPO对照组309445±0010710044±000225U/mlrhEPO组312779±00055ab14176±00055ab10U/mlrhEPO组307703±00045abc09186±00035abc20U/mlrhEPO组303337±00093abcd04766±00022abcdRho激酶抑制剂组313904±00019acd02489±00046abcdF值682939731724282P值<001<001

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与高糖诱导组比较，bP<0.05；与5 U/ml rhEPO组比较，cP<0.05；与10 U/ml rhEPO组比较，dP<0.05

2.2 高糖与rhEPO对α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达的影响 各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中高糖诱导组、不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均高于空白对照组，E-cadherin均低于空白对照组；不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于高糖诱导组，E-cadherin均高于高糖诱导组；10 U/ml rhEPO组与20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组；Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组；20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO组；Rho激酶抑制剂组α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 相关性分析 Pearson直线相关分析显示，高糖诱导组、不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.885、0.901、0.886、0.868，P<0.05)。

3 讨论

DN纤维化主要发生于肾小球及肾小管间质[3]，其肾纤维化贯穿于早期DN至临床期DN。一些患者在糖尿病早期即有肾间质纤维化，但最主要是与DN患者肾功能下降有密切关系[4]。以往研究显示，低氧诱导因子1(HIF-1)与RhoA/ROCK信号通路存在相关性[5]，而EPO是HIF-1主要的靶基因之一，因此推测EPO与RhoA/ROCK信号通路也存在着一定联系。ROCK抑制剂Y27632和法舒地尔阻断糖尿病鼠肾组织中的RhoA/ROCK通路后，可以改善肾小球通透性、肾脏血流动力学、代谢指标及延缓肾小球硬化进展、抑制活性氧自由基的形成，减少细胞外基质蛋白的沉积。意味着RhoA/ROCK信号通路可能参与DN进展的过程。本实验发现，给予不同浓度rhEPO(5、10、20 U/ml)干预后，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA显著下调，且随着rhEPO浓度升高，抑制作用更加明显；给予抑制剂Y27632后，ROCK1 mRNA表达明显下调，免疫荧光及ELISA结果显示，Rho激酶抑制剂组E-cadherin蛋白表达较高糖诱导组明显增加，α-SMA、FN表达明显减少。Pearson直线相关分析显示，不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA呈正相关。因此，笔者推测rhEPO可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路抑制上皮间质转化(EMT)过程，而发挥延缓肾纤维化的作用。

表2 各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达水平的比较

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与高糖诱导组比较，bP<0.05；与5 U/ml rhEPO组比较，cP<0.05；与10 U/ml rhEPO组比较，dP<0.05;FN=纤维连接蛋白，IL-6=白介素6，TNF-α=肿瘤坏死因子α

DN患者肾活检证实发生EMT，并发现其与肾间质纤维化及胶原蛋白的表达密切相关[6]。E-cadherin是一种存在于各种类型上皮细胞中的跨膜糖蛋白，α-SMA是一种表达于血管平滑肌细胞的骨架蛋白，正常情况下在肾组织中的表达仅见于平滑肌源性细胞，正常成熟HK-2细胞主要表达角蛋白、E-cadherin等上皮细胞标志物，几乎不表达α-SMA。α-SMA蛋白可作为DN肾纤维化发生的标志[7]。HK-2细胞EMT过程的特征是E-cadherin蛋白的丢失和α-SMA蛋白、FN表达的升高。根据Tang等[8]研究，本研究选择30 mmol/L D-葡萄糖体外培养HK-2细胞为诱导浓度，以作用24 h为诱导时间。免疫荧光结果显示，空白对照组HK-2细胞形态呈现典型的上皮细胞表型：E-cadherin高表达，α-SMA弱表达；高糖诱导组上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达显著较少，肌成纤维细胞标志物α-SMA蛋白表达显著增加，证实高糖可诱导HK-2细胞EMT的发生。rhEPO除具有刺激造血作用外，还是拥有许多器官保护作用的多效性糖蛋白激素[9]，其可以通过降低血肌酐及尿素氮，从而改善药物如庆大霉素等诱导的小鼠肾小管损伤性肾功能损害[10]，对脂多糖诱导的急性肾功能损害模型也具有保护作用[11]。本实验发现，给予高糖诱导HK-2细胞发生EMT过程的同时加入不同浓度rhEPO(5、10、20 U/ml)干预，干预组E-cadherin蛋白的表达较高糖诱导组明显增加，α-SMA蛋白的表达明显下降，并且随着rhEPO浓度的升高，其抑制转分化的作用更加明显，表明rhEPO可抑制高糖诱导的EMT过程，延缓肾间质纤维化的进展，与郑开元[12]研究结果一致。

传统观念认为，DN是非免疫性疾病，20世纪90年代末首次提出免疫系统的激活及微炎性反应与DN密切相关[13]。现在越来越多的证据显示，免疫及炎症机制在DN中发挥着重要作用[1，14]。多项研究证实，IL-6、TNF-α、超敏C反应蛋白在DN患者体内均升高[15-17]。因此，进一步探讨炎症及促炎因子在DN发展中的作用，可以从改善微炎症角度寻找延缓DN进展的新药物作用靶点。

TNF-α的表达不仅限于血源性细胞与肾脏的固有细胞，如系膜细胞、内皮细胞、HK-2细胞等均能表达TNF-α[18]。1991年，Hasegawa等[19]首次提出促炎细胞因子TNF-α能显著促进DN发展。DN患者血清TNF-α水平明显高于单纯糖尿病而无DN患者[20]。实验研究报道，糖尿病小鼠肾小球和近端HK-2细胞TNF-α基因表达及蛋白表达均明显增多，并且是DN患者尿蛋白排泄增多的直接、独立的因素[21]。1991年，Sekizuka等[22]报道，DN患者血清IL-6水平明显高于非DN患者。应用原位杂交技术发现，DN患者肾脏中的系膜细胞、肾小管细胞和浸润细胞均可表达IL-6 mRNA。IL-6参与肾小球基底膜宽度的增加。由IL-6介导的肾脏损伤可能与改变内皮细胞通透性、增强系膜细胞的增殖能力及增加FN的表达有关[23]。IL-6 mRNA在肾间质、肌成纤维细胞(HK-2细胞转分化而来)中强烈表达，其表达量与间质损害程度相关[24]。在DN出现临床症状之前，其实就已经有炎性反应的发生[25]，其可能机制是DN患者体内的高糖毒性使肾小球基底膜支架结构孔径增粗，引起肾小球微血管通透性升高，产生病理变化，导致炎性因子的表达增多，从而引起DN患者的蛋白尿。本实验发现，给予高糖刺激HK-2细胞，IL-6、TNF-α蛋白浓度明显升高，给予rhEPO干预或Y27632处理后，其表达明显减少，且具有rhEPO浓度依赖性。推测，rhEPO对高糖环境下HK-2细胞的抗感染作用可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

综上所述，rhEPO可通过阻断RhoA/ROCK信号通路抑制HK-2细胞EMT过程，且还可以通过减少炎性因子的产生，减轻炎性反应，延缓DN进展。但其机制复杂，可能同时涉及多条信号通路、多种细胞因子的共同参与，且本研究采用的是体外HK-2细胞培养的方式进行，所得实验结果不能完全反映临床实际情况。今后仍需进一步研究EPO对其他通路、其他细胞因子的影响，为是否可通过抑制多条通路的活化更强地延缓DN的进展提供更多的实验证据。

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(本文编辑：贾萌萌)

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2015年ADA糖尿病诊疗标准仍关注个体化治疗

由美国糖尿病协会(ADA)更新的《2015年ADA糖尿病诊疗标准》强调需对每例患者给予个体化管理。美国Joslin糖尿病中心的Giulio R.Romeo和Martin J.Abrahamson在2015年3月24日发表于《内科学年鉴》(Ann Intern Med)的述评中指出，根据新指南，非内分泌科医生在接诊糖尿病患者时有3个值得注意的地方：

(1)在亚裔美国人群中筛查糖尿病前期和2型糖尿病时，需将体质指数(BMI)切点降至23 kg/m2，而不能使用25 kg/m2。研究者指出，亚洲人群糖尿病漏诊的现象很普遍。在易感人群中筛查糖尿病时采用较低的BMI切点会更好地检出糖尿病或糖尿病前期患者。

(2)糖化血红蛋白(HbA1c)目标值和治疗方案需根据每例患者的年龄、合并症、预期寿命和生活方式而定。新指南也推荐联合用药，但指出应考虑患者的低血糖风险、不良反应、治疗对体质量的影响和花费问题。

(3)新指南推荐的收缩压和舒张压目标值分别为140 mm Hg和90 mm Hg。医生应认识到患者发生动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的风险。不论初始低密度脂蛋白胆固醇水平如何，对≥40岁的糖尿病患者应给予更强化的他汀治疗，同时监测其服药依从性。

Romeo和Abrahamson指出，《2015年ADA糖尿病诊疗标准》继续强调个体化治疗，再次强调了以患者为中心的原则。

(摘自“医脉通”网站)

Effect and Possible Mechanism of rhEPO in the Transdifferentiation of Human Kidney Proximal Tubular Epithelial Cells Induced by High Glucose and the Changes of Inflammatory Cytokines

CHENYan-xia,YANGLi-ping,WUXian-feng，etal.

DepartmentofNephrology，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China

Objective To investigate the effect and possible mechanism of rhEPO in the transdifferentiation of human kidney proximal tubular epithelial cells(HK-2 cells)induced by high glucose and the changes of inflammatory cytokines.Methods By using random number table，HK-2 cells cultured in vitro were divided into several groups：blank control group(with no irritants)，high glucose induced group (with a high glucose final concentration of 30 mmol/L)，mannitol control group(with a mannitol concentration of 24.5 mmol/L)，rhEPO control group(with a rhEPO final concentration of 20 U/ml)，three rhEPO intervention groups(with a rhEPO final concentration of 5，10 and 20 U/ml respectively and high glucose added)，Rho kinase inhibitor(Y27632)group(in which Y27632 with a final concentration of 30 μmol/L was added and high glucose was added 30 minutes later with a final concentration of 30 mmol/L).After 24 h in virto culture，reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to evaluate the mRNA levels of RhoA and ROCK.The levels of E-cadherin and α-smooth muscle actin(α-SMA)proteins were assessed by immunofluorescent test.ELISA was used to measure the levels of Fibronectin(FN)，IL-6 and TNF-αproteins.Results The groups were all significantly different(P<0.05)in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the high glucose induced group and the 5 U/ml rhEPO intervention group were higher(P<0.05)than the blank control group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group and the Y27632 group were lower(P<0.05)than the blank control group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the three rhEPO intervention groups were lower(P<0.05)than the high glucose induced group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the Y27632 group was lower(P<0.05)than the high glucose induced group in the mRNA levels of ROCK；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group were lower(P<0.05)than the 5 U/ml rhEPO intervention group in the mRNA levels of RhoA and ROCK；the 20 U/ml rhEPO intervention group was lower(P<0.05)than the 10 U/ml rhEPO intervention group in the mRNA levels of RhoA and ROCK.The groups were significantly different(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，E-cadherin，FN，IL-6 and TNF-α；the high glucose induced group，the three rhEPO intervention groups and the Y27632 group were higher(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and were lower(P<0.05) in E-cadherin than the blank control group；the three rhEPO intervention groups and the Y27632 group were lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and were higher(P<0.05)in E-cadherin than the high glucose induced group；the 10 U/ml rhEPO intervention group and the 20 U/ml rhEPO intervention group were lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-α and higher(P<0.05)in E-cadherin than the 5 U/ml rhEPO intervention group；the Y27632 group was lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA and FN and were higher(P<0.05)in E-cadherin than the 5 U/ml rhEPO intervention group；the 20 U/ml rhEPO intervention group was lower(P<0.05)in the protein levels of α-SMA，FN，IL-6 and TNF-αand was higher(P<0.05)in E-cadherin than the 10 U/ml rhEPO；the Y27632 group was lower(P<0.05)than the 10 U/ml rhEPO intervention group in the protein levels of α-SMA，E-cadherin and FN.The pearson linear correlation analysis showed that the mRNA level of RhoA was positively correlated with the mRNA level of ROCK1 in the high glucose group and the three rhEPO intervention groups(r=0.885，0.901，0.886，0.868；P<0.05).Conclusion rhEPO could inhibit the transdifferentiation of HK-2 cells induced by high glucose to delay the fibrosis of renal.rhEPO can also reduce the production of inflammatory cytokines，the generation of inflammatory cytokines and inflammatory response，thus delaying the progression of diabetic nephropathy and the fibrosis of renal interstitium.The mechanism may be related to RhoA/ROCK signaling pathway.

Diabetic nephropathies；Erythropoietin；Cell transdifferentiation；Interleukin-6；Tumor necrosis factor-alpha；RhoA/ROCK signaling pathway

江西省自然科学基金资助项目(20122BAB205006)

330006江西省南昌市，南昌大学第二附属医院肾内科(陈艳霞，吴险峰，秦晓华，黄翀，房向东，涂卫平)；江西省肿瘤医院(杨丽萍)

房向东，330006江西省南昌市，南昌大学第二附属医院肾内科；E-mail：xiangdongfang818@sina.com

R 587.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.20.018

2015-01-27；

2015-04-11)