大蒜素对膀胱癌细胞增殖和B细胞淋巴瘤-2表达的影响

黄从兵, 唐再军, 谢远杰, 胡爱民,

刘芳1, 刘珊珊1, 龙治峰2

(1. 湖南黑金时代长沙矿业有限公司职工医院, 湖南 长沙, 410600;

2. 南华大学医学院 组织学与胚胎学教研, 湖南 衡阳, 421001)

大蒜素对膀胱癌细胞增殖和B细胞淋巴瘤-2表达的影响

黄从兵1, 唐再军1, 谢远杰2, 胡爱民1,

刘芳1, 刘珊珊1, 龙治峰2

(1. 湖南黑金时代长沙矿业有限公司职工医院, 湖南 长沙, 410600;

2. 南华大学医学院 组织学与胚胎学教研, 湖南 衡阳, 421001)

摘要:目的探讨大蒜素对膀胱癌BIU-87细胞的增殖及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达的影响。方法用不同浓度的大蒜素处理膀胱癌BIU-87细胞36 h, 以噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长抑制率，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Bcl-2 mRNA的表达，蛋白免疫印迹技术检测Bcl-2蛋白表达的变化。结果与对照组比较，经大蒜素处理的BIU-87细胞的生长抑制率增加(P<0.05), 且效应呈浓度和时间依赖性(P<0.05)；大蒜素处理细胞后，BIU-87细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白质的表达水平下调(P<0.01)。结论大蒜素能抑制BIU-87细胞的增殖，且呈剂量和浓度依赖性，其机制可能与大蒜素下调Bcl-2 mRNA和蛋白的表达有关。

关键词:大蒜素; 膀胱癌; B细胞淋巴瘤/白血病基因-2

Influence of allicin on proliferation of bladder

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，其中绝大多数为移行细胞癌。膀胱癌属于化疗敏感性肿瘤，但容易对化疗药物产生耐药性而复发。大蒜素是多种含硫化合物的复合体，是从大蒜鳞茎中分离的一种有机化合物，由存在的蒜氨酸在蒜酶作用下转化产生，具有多种生物学作用，如抗菌、降血压、降血脂和抗肿瘤等[1-2]。大蒜素(allicin)中所含有的有机硫化合物的抗肿瘤作用已被得到证实，这些有机硫化物可以通过许多途径抑制肿瘤的发展，包括加速致癌物的解毒、细胞周期的停滞、诱导细胞凋亡和抑制血管生成等。B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)是一种原癌基因，研究[3]表明Bcl-2能够抑制细胞的凋亡而促进细胞的生长, Bcl-2能够抑制多种因素诱导的多种细胞凋亡，其高表达是肿瘤细胞对化疗耐药的原因之一。

本文以膀胱癌细胞株BIU-87细胞为研究对象，观察大蒜素对细胞增殖的影响及细胞中Bcl-2表达的变化，探讨大蒜素对膀胱癌细胞生长的影响及可能机制，为临床膀胱癌的治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

大蒜素注射液(山西普德药业股份有限公司)，逆转录及PCR试剂盒购自康为试剂有限公司，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；抗体购自武汉博士德公司。噻唑蓝(MTT)比色法试剂盒购自武汉博士德，ECL发光试剂盒产自碧云天生物技术研究所。

1.2细胞培养及分组

BIU-87细胞株(膀胱移行细胞癌株)购自武汉细胞保藏中心。细胞贴壁生长于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibo BRL公司)中，置于含5%CO2、37 ℃恒温饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d传代以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA) 1∶1(V/V)混合的消化液进行传代，取对数生长期细胞用于实验。

大蒜素注射液(规格: 2 mL∶30 mg)配成1 g/L的贮存液, 4 ℃保存，实验时分别加于培养基中处理细胞(使终浓度分别达到实验分组中各组的要求的浓度)。实验分为对照组(不加大蒜素)和不同浓度大蒜素组(浓度分别为25、50、75、100 mg/L)。

1.3噻唑蓝(MTT)比色法测细胞活力

1.4逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Bcl-2基因的表达

按TRIzol试剂盒说明提取细胞总RNA，按相关试剂盒中操作说明进行逆转录反应。Bcl-2引物序列为: 5′- GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA -3′, 5′- AGGCACCCAGGGTGATGCA A-3′, 扩增片断304bp。以GAPDH为内参照，其引物序列为: 5′-AGCGGGAAATCGTGC GTGAC-3′, 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′, 扩增片段471 bp。RT-PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，溴化乙淀染色，UVP型凝胶成像系统拍照后进行图像分析，以与内参的灰度比值代表Bcl-2表达的变化。

1.5Western免疫印迹检测Bcl-2蛋白的表达

按常规方法提取培养细胞的总蛋白，以BCA法测蛋白浓度。参考《分子克隆实验指南》第二版本的方法配制分离胶和集成胶，上样后进行垂直电泳m, 转PVDF膜后，以10%脱脂奶粉封闭(常温下摇育2 h)，再依次孵育Bcl-2及内参β-actin的一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗，最后以Western免疫荧光检测试剂激发荧光，于暗室中显影于X光片。结果用凝胶图像分析系统对胶片扫描进行半定量分析。

1.6实验结果分析

2结果

2.1大蒜素对膀胱癌细胞生长抑制率的影响

以MTT法检测培养的BIU-87细胞的生长抑制率，结果显示，不同浓度(25、50、75、100 mg/L)大蒜素处理细胞36 h后，或100mg/L大蒜素处理细胞不同时间(12、24、36、48 h)后，其细胞代谢MTT的能力明显降低，各组间细胞生长的抑制率明显上升，说明大蒜素可以抑制膀胱癌细胞的生长，并且这种效应随着大蒜素浓度的增加或时间的延长而逐渐增强(P<0.05)，见图1。

A. 不同浓度的大蒜素对膀胱癌细胞生长抑制率的影响; B. 100 mg/L大蒜素作用于细胞不同时间后膀胱癌

细胞生长抑制率的变化(*与对照组比较，P<0.05, #两组间比较，P<0.05)

图1MTT法分析大蒜素对膀胱癌细胞生长抑制率的影响2.2大蒜素对膀胱癌细胞Bcl-2基因表达的影响

不同浓度的大蒜素(0、25、50、75、100 mg/L)作用于膀胱癌BIU-87细胞36 h后，与对照组比较, BIU-87细胞中Bcl-2 mRNA的表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01), 且随大蒜素浓度的增加, Bcl-2 mRNA表达下调的趋势越明显，见图2。

与对照组比较,*P<0.01;两组间比较,#P<0.01图2 大蒜素对膀胱癌细胞Bcl-2mRNA表达的影响

2.3大蒜素对对膀胱癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响

采用Western免疫印迹法检测不同浓度的大蒜素(25、50、75、100 μmol/L)处理膀胱癌细胞株后，细胞Bcl-2蛋白表达的影响。结果发现，随着大蒜素浓度的增加，细胞Bcl-2蛋白的表达明显下调(P<0.01), 见图3。

与对照组比较,*P<0.01;两组间比较,#P<0.01图3 大蒜素对膀胱癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响

3讨论

膀胱癌在全球恶性肿瘤中已位居第9位[4], 也是中国人群中最常见的泌尿系统恶性肿瘤，也是泌尿系统病死率最高的肿瘤，其早期诊断及复发进展监测仍以有创的膀胱镜和尿脱落细胞学为重要方法，在基因水平上的研究主要集中于癌基因突变，抑癌基因失活等方面的研究[5-6]。Bcl-2是一种完整膜蛋白，定位于线粒体外膜、内质网和核膜，现已发现大多数人类癌和癌前病变组织中有Bcl-2的异常表达。Bcl-2能够阻止多种刺激物和治疗如化疗药物、放射、过氧化氢、生长因子撤除、神经毒素等引起的凋亡[7-8]。作者在研究中也发现，膀胱癌细胞株BIU-87细胞中Bcl-2表达发生变化，与其细胞生长抑制率也受到明显的影响。此外，还有研究结果表明，与Bcl-2阳性膀胱肿瘤比较，Bcl-2阴性者对顺铂敏感性高，复发率低(40%), 进展率低(5%); 前者的复发率和进展率分别为55.0%和36.0%[9-10]。探讨凋亡抑制基因Bcl-2对膀胱肿瘤细胞凋亡的调控作用对认识膀胱肿瘤的发生、发展以及预防和治疗等具有重要意义。

大蒜素又名大蒜新素，化学名为二烯丙基三硫化物(CH2=CH-CH-S-S-S-CH2-CH=CH2)，是从大蒜鳞茎中分离的一种有机化合物，可分为脂溶性和水溶性，其中脂溶性成分包括二烯丙基一硫(DAS)、二烯丙基二硫(DADS)和二烯丙基三硫(DATS)，水溶性成分包括S-丙烯丙基半胱氨酸(SAC)和S-丙烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)[11-12]。研究[13]发现，大蒜素可通过多水平、多个作用靶点诱导肿瘤细胞凋亡的，其主要作用机制表现为直接杀伤、抗氧化、特异性阻滞细胞周期、调节癌基因和抑癌基因的表达、调节机体免疫功能、对抗癌药物的增敏和抗耐药作用等。王保才等[14]研究发现，大蒜素对胰腺癌 PANC-1细胞有抑制作用且呈现剂量依赖性，大蒜素浓度越高，其抑制率也越高，另外其作用也与药物作用时间有关系。大蒜素还可通过影响细胞周期和/或诱导细胞凋亡等途径发挥抗结肠癌LoVo细胞、直肠癌细胞、胆管癌QBC939细胞的作用。大蒜素可诱导人宫颈腺癌Hela细胞和Caski细胞的凋亡，且其抑制作用也随着时间和剂量的增加而有所增加。本研究中作者发现，不同浓度梯度的大蒜素处理细胞，或同一浓度大蒜素处理细胞不同时间，均可使膀胱癌BIU-87细胞的生长明显受到抑制，且这种效应呈浓度和时间依赖性，这表明大蒜素在体外可以抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖。国内李永生等研究发现，大蒜素可增强长春新碱对膀胱癌BIU-87细胞增殖抑制作用，两者具有协同抗肿瘤作用，并提示大蒜素诱导细胞凋亡的机制可能与下调CDK1和CyclinB1的表达有关[12]。本研究中，作者采用大蒜素处理膀胱癌BIU-87细胞后，结果发现细胞中Bcl-2基因和蛋白质的表达逐渐降低，提示大蒜素可能通过抑制抑制细胞的Bcl-2的表达而抑制膀胱癌BIU-87细胞的生长。

总之，作者采用大蒜素处理膀胱癌细胞株，发现细胞的生长明显受到抑制，且这种效应呈现明显的浓度和时间效应，这表明大蒜素在体外可以抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖。此外，在研究中还发现，大蒜素处理BIU-87细胞后，细胞中Bcl-2基因和蛋白质的表达逐渐降低，提示大蒜素可抑制BIU-87细胞中Bcl-2的表达。本研究结果表明，大蒜素可抑制膀胱癌BIU-87细胞的生长，其机制可能与大蒜素抑制细胞的Bcl-2的表达有关。此外，有研究表明大蒜素还可通过多种途径发挥抗乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌作用[15], 本研究及国内外相关研究都说明大蒜素可能成为一种潜在的抗肿瘤新药。

参考文献

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cancer cells and expression of B-cell lymphoma-2

HUANG Congbing1, TANG Zaijun1, XIE Yuanjie2, HU Aimin1,

LIU Fang1, LIU Shanshan1, LONG Zhifeng2

(1.Worker′sHospitalofHunanBlackGoldEraChangshaMiningLimitedCompany,Changsha,

Hunan, 410600; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,UniversityofSouthChina,

Hengyang,Hunan, 421001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of allicin on proliferation of BIU-87 cells of bladder cancer and expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2). MethodsDifferent concentrations of allicin were used to process BIU-87 cells for 36 hours. Growth inhibitory rate of cell was evaluated by MTT assay, the mRNA expression of Bcl-2 was detected by RT-PCR, and protein expression of Bcl-2 was detected by Western blot. ResultsCompared with control group, the growth inhibition rate increased in BIU-87 cells processed by allicin (P<0.05), and the effect was dependent on concentration and time. The mRNA and protein expressions of Bcl-2 decreased significantly in BIU-87 cells processed by allicin (P<0.01). ConclusionAllicin can inhibit the growth of BIU-87 cells, the effect is dependent on concentration and time, and its mechanism may be correlated with down-regulation of Bcl-2 mRNA expression and protein by allicin.

KEYWORDS:allicin; bladder cancer; B-cell lymphoma-2

收稿日期:2014-12-09

中图分类号:R 737.14

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)03-023-04

DOI:10.7619/jcmp.201503006