基于连接酶-琼脂糖凝胶电泳的单核苷酸多态性快速检测方法＊

崔海忠，肖 娜，张永平，陈大贵，唐一通△，赵雪红，邵金辉

（湖北文理学院医学院：1.枣阳临床学院肿瘤科，湖北枣阳441200；2.分子医学重点实验室，湖北襄阳441053）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列上发生的单个核苷酸碱基的变异，在人群中的分布率占1%以上。SNP是人类基因组中最常见的变异形式，现有公共数据库中已经报道了超过900万个SNP位点。SNP被认为是疾病易感性和药物反应的决定因素，开展SNP 研究对医学、法医学、遗传学、临床诊断、药物开发与合理用药等的发展都具有非常重要的意义［1］。SNP 的基因分型检测工作，已成为当前国际上研究的热点。近年来，随着生物学实验技术的快速发展，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很快。目前，有20余种SNP突变检测方法，如限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）［2］，PCR-SSCP［3］，DNA 测序，实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）［4］，TaqMan PCR［5］，焦 磷 酸 测 序（Pyrosequencing）［6］，质谱（Mass Spectrometry）［7］，连接酶链反应（Ligase Detection Reaction）［8］，基 因 芯 片［9］，SNPstream 技术［10］，分子灯塔技术［11］等。其中DNA 直接测序是传统的序列测定的方法，但是其检测灵敏度低，在对肿瘤组织、穿刺活检组织或体液等不均一样本进行SNP突变检测时具有较大局限性。虽然Pyrosequencing、荧光定量PCR、质谱等方法具有较高的灵敏度，但这些方法对实验条件、实验仪器设备具有很高的要求，在简单实验条件下的常规临床检测中很少能够应用。本研究建立了一种基于连接酶-凝胶电泳的简便、快速、灵敏的SNP突变检测方法，适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测。并对在非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂药物个体化治疗中的生物标记基因表皮生长因子受体（EGFR）为检测对象，对有较高突变频率的EGFR，c.2573T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3个SNP位点进行了分型检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从枣阳临床学院肿瘤科62 例非小细胞肺癌血浆样本中抽提循环DNA，-20 ℃保存。（1）检测样本：携带有野生型和突变型等位基因的EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3个SNP突变位点的质粒DNA 以黄杰等［12］定点突变技术进行构建。寡核苷酸探针：针对每个SNP位点，用3条寡核苷酸探针进行检测。分别为上游的两条特异性检测探针和下游的一条公用探针（图1）。在两条特异性探针的5′端，为一段通用扩增引物序列Tag1，3′端为与模板上突变位点一侧的序列互补的序列，并且3′末端碱基与突变位点碱基对应互补，野生型检测探针（WT-Probe）与野生型等位基因互补，突变型检测探针（MT-Probe）与突变型等位基因互补，在特异性探针的5′端分别进行生物素修饰。公用检测探针5′端为与SNP位点另一侧序列互补的序列，3′端为一段通用扩增引物序列Tag2。对EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3个SNP位点进行检测的探针序列，见表1。对检测探针进行通用扩增的Tag1序列和Tag2的互补序列（CTag2）分别为：Tag1：5′-TTT TTT TGG GTT CGT GGT AGA GCG TCG GAG T-3′；CTag2：5′-CCA GAC GAC ACC GAG ATA GCA GCC-3′。（2）实验试剂：Low MW DNA Marker-A 购自生工生物工程（上海）有限公司，2×PCR Mastermix购自天根生化科技北京有限公司，链亲和素（Streptavidin）磁珠购自西安金磁纳米生物技术有限公司，Taq DNA ligase购自New England BioLabs。TA 克隆试剂盒、TaKaRa Ex Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司产品。QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）购自上海叶舟生物科技有限公司。核酸序列均由上海生工生物有限公司合成。其余试剂均为分析纯。

图1 检测探针设计示意图

表1 寡核苷酸检测探针序列

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因扩增对基因外显子18和21进行PCR扩增，扩增引物为：exon 21-forward：5′-GAG CTT CTT CCC ATG ATG ATC T-3′；exon 21-reverse：5′-GAA AAT GCT GGC TGA CCT AAA G-3′；exon 18-forward：5′-GAG GTG ACC CTT GTC TCT GTG T-3′；exon 18-reverse：5′-CCC AAA CAC TCA GTG AAA CAA A-3′。扩增体系为：3μL 循环DNA 样本，0.5μmol／L扩增引物，15μL 2×Taq PCR Mastermix，去离子水补足30μL。扩增条件为：95°C 预变性4 min，95°C 变性30s，60°C 退火30s，72°C 延伸40s，35 个循环；72°C再延伸4min。各样本扩增产物用直接测序法测定突变类型。

1.2.2 连接反应 针对每个SNP位点，用两个检测管进行检测，并分别标记为WT 管和MT 管。两管分别加入3μL 10×连接反应缓冲液，5μL 模板序列和1 U 的Taq ligase，在MT管中加入50fmol突变型特异性检测探针和公用检测探针，WT 管中加入50fmol野生型特异性检测探针和公用检测探针，去离子水补足30μL。对于每个检测位点，设定一对照管CT，对照管中不加入模板序列，其它成分与检测管相同。反应条件为：94 ℃变性40s，60 ℃退火5min；5个循环；95℃变性5min。

1.2.3 纯化反应 按照Streptavidin 磁珠操作说明，对各SNP位点对应各管扩增产物进行纯化。加入20μL Tris-HCl（10mmoL，pH7.5）重新悬浮磁粒。

1.2.4 通用扩增反应 取15μL 2×PCR Mastermix，5μL各管对应纯化磁性微粒，2μmol／L 的通用扩增引物Tag1 和CTag2，去离子水补足30μL。95℃预变性30s；95℃变性25 s，60℃退火45s，72℃延伸20s；20个循环，72℃延伸1min进行扩增反应。

1.2.5 扩增产物检测 分别取各SNP突变位点对应MT 管、WT 管和CT 管扩增产物5L 进行3.5%琼脂糖凝胶电泳，根据3个反应管对应泳道在目标位置电泳条带出现的情况判定检测突变位点基因型。如果WT 管和MT 管对应泳道均出现条带，则该SNP位点为野生／突变型；如果只有WT 管对应泳道出现条带，则该SNP位点为纯合野生型；如果只有MT 管对应泳道出现条带，则检测SNP为纯合突变型。

2 结 果

2.1 检测方法流程 通过连接反应，WT 管中野生型检测探针和公用探针能够完成连接，而MT 管中突变型检测探针和公用探针不能连接。经链亲和素磁性微粒的纯化反应，WT 管中完成连接反应的探针被纯化固定在链亲和素磁性微粒上。以Tag1和CTag2作为通用引物，对WT 管和MT 管中磁性微粒纯化产物进行通用扩增反应，最后在琼脂糖凝胶电泳水平对突变位点进行分型检测。通过观察WT 管和MT 管对应电泳泳道条带的出现情况进行结果判定。WT 管对应泳道出现条带，而MT 管对应泳道无条带，说明检测SNP位点为野生纯合子基因型。野生纯合子SNP位点的检测示意图，见图2。

图2 分型方法检测流程图

2.2 连接温度的优化 进行连接反应时，退火温度是影响反应灵敏度及特异性的一个重要因素，特异性会随着退火温度的升高而有所提高，但是较高的退火温度也会使得退火效率降低从而影响检测的灵敏度。以L858R 野生型质粒模板为检测对象，分别在55、60、65 ℃的退火温度条件下，经检测探针的连接，纯化和PCR 扩增，扩增产物的凝胶电泳结果如图3所示，在55、60 ℃两个温度梯度条件下，均明显在WT 管对应泳道出现扩增条带，而其余泳道均无扩增条带出现；但是当退火温度上升为65 ℃时，3个泳道均无扩增条带出现。说明检测探针在检测模板上的退火能力随着反应温度的升高而降低，在55～60℃时能够有效的保证检测探针在检测模板上的退火从而完成连接反应。但是在65 ℃条件下，检测探针无法有效的退火到模板上，使得连接反应不易完成，从而无目的扩增条带的出现。因为在对检测探针设计时，将所有检测探针上H1、H2序列的Tm 值均设计为58～60℃，所以为了即能够保证探针在模板上的有效退火，又能够保证连接反应的特异性，选定60 ℃作为连接反应的温度。

图3 连接温度的优化

2.3 特异性检测 通过扩增反应中的循环次数对本方法的特异性进行检测，分别对L858R 野生／突变混合模板和L861Q 、G719C两个野生型等位基因模板进行检测。分别作20和30个循环的扩增，将各管5μL 扩增产物做3.5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。两种循环条件下，在L858R 位点的MT管和WT 管对应泳道中均出现明显扩增条带，而G719C 和L861Q 两个位点对应的WT 管泳道出现扩增条带，MT 泳道均未有条带出现。同时，3个位点对应CT 管泳道均未出现条带。说明此方法具有较高的检测特异性和扩增容量。

图4 分型方法特异性检测

2.4 敏感性检测 以L858R 位点为检测对象，分别设定突变等位基因在总检测模板中的比例为50.00%、25.00%、5.00%、2.50%，对不同比例的混合等位基因进行检测。结果如图5所示，各条件下，在MT 和WT 管对应的泳道中均有扩增条带出现，且随着突变型等位基因所占比例的减少，MT 管对应泳道中扩增条带亮度逐渐减弱，但当突变等位基因在混合等位基因中比例低至2.50%时，仍能够在MT 管对应泳道中检测出扩增条带，说明本方法有着较高的检测灵敏度，适合于从不均一的样本中对突变等位基因进行检测。

图5 L858R 位点琼脂糖凝胶电泳水平敏感度检测

2.5 样本检测 利用本方法对62 例样本中EGFR，c.2573 T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3个SNP位点进行了检测，并与直接测序结果进行了比较。两种方法未检测到L861Q 和G719C 位点的突变，但均检测到L858R 位点有杂合子突变。如图6所示，通过直接测序方法仅可以明确检测出8＃和15＃两例样本是L858R 位点杂合子突变，23＃样本出现类似杂峰的突变碱基对应峰，故无法给出明确的基因型判断。而通过连接酶-琼脂糖凝胶电泳方法共检测出8＃，15＃，23＃，6＃，11＃，14＃共6例样本是L858R 杂合子突变（图7）。结果证明，连接酶-琼脂糖凝胶电泳方法比直接测序方法具有更高的灵敏度，适合于对不均一样本或杂合子突变位点的检测。

图6 循环DNA 样本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位点突变测序图

图7 样本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位点突变检测图

3 讨 论

随着人类生物信息学资源的爆炸性积累，极大地推动了SNP突变检测技术的发展。但是，SNP 突变检测技术在检测成本、灵敏性和常规性等方面仍需要进行改进。如传统的DNA 直接测序方法的灵敏度只有20%［13-14］，检测位点突变等位基因对应测定峰线很低，无法明确从背景峰中分离（图6），因此，不能够从不均一样本中对突变等位基因进行检测。虽然实时定量PCR、焦磷酸测序，以及质谱等检测方法的灵敏度较高，文献报道称可达到1%［14-15］，但是这些检测方法都要求具备昂贵的检测设备和实验试剂，因而不能够在常规实验条件下进行突变检测，限制了其在基层医疗或研究机构的应用。

本研究建立的SNP突变检测方法基于连接酶反应原理，通过检测探针的连接反应，链亲和素磁性微粒对连接探针的纯化反应以及通用扩增引物的扩增反应，利用琼脂糖凝胶电泳方法进行SNP突变位点的分型检测。本方法具有较高的检测灵敏度，能够从野生／突变位点所在混合质粒模板中检测出低至2.50%的突变型等位基因，因此，适合于从不均一样本中对突变等位基因进行检测。而且，与其他检测方法如荧光定量PCR，质谱，DNA 直接测序等方法相比，本方法操作简单，不需要借助昂贵的实验仪器设备，只需普通PCR 仪、凝胶电泳等简单实验条件即能完成，同时，所需探针长度均小于50bp，合成成本低，没有对荧光探针等昂贵试剂及高质量检测样本的要求，具有较低的实验成本和易操作性，因此，更适合于在常规、简单实验条件下的突变检测。

本方法较高的检测特异性通过以下条件保证：（1）在设计检测探针时，除了依靠特异性检测探针3′端碱基与突变碱基的配对识别能力外，还在其3′端上游第3个碱基处引入1个错配碱基以增强探针的识别能力；（2）特异性检测探针和公用探针的H1和H2序列的Tm 值与通用扩增引物Tag1 和Tag2序列的Tm 值相差7～8度，以减少连接反应和后续的扩增反应之间的影响；（3）高保真性Taq DNA 连接酶对错配碱基的识别作用。本方法同时具有较高检测灵敏度，其是通过在探针序列上设计通用扩增引物序列Tag1和Tag2，完成连接反应后，进行了连接产物的二次扩增以极大增加连接产物的数量，从而能够在琼脂糖凝胶电泳水平进行快速检测。但琼脂糖凝胶电泳的检测灵敏度具有局限性，因此，当突变等位基因在不均一样本总的比例低至2.50%时，就不能够得以检测。同时，在检测通量上也有限制，不适合于进行高通量的突变检测。

综上所述，本研究建立了一种基于连接酶-凝胶电泳的SNP分型新方法，并对与酪氨酸激酶抑制剂个体化用药密切相关的EGFR 基因的3个常见SNP位点EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）进行了检测。该方法操作简便，有较高的检测特异性和灵敏度，适合于在一般实验条件下对不均一样本进行常规突变检测。

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