基于双启动寡聚核苷酸引物的沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌多重实时荧光PCR方法的建立*

梁 红，李 明，贾 昕，许军强

(华美生物工程有限公司，河南洛阳 471003)



·论 著·

基于双启动寡聚核苷酸引物的沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌多重实时荧光PCR方法的建立*

梁 红，李 明，贾 昕，许军强

(华美生物工程有限公司，河南洛阳 471003)

目的 建立多重实时荧光PCR同时检测沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌的方法。方法 通过设计针对沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌和耶尔森菌的双寡聚核苷酸引物，来建立这4种病原体的多重PCR检测体系。结果 建立的多重PCR体系可同时特异性扩增4种病原体的DNA片段。沙门菌和弯曲杆菌的特异性和敏感度都是100.0%，志贺菌和耶尔森菌的敏感度是100.0%，特异性分别是99.3%和98.6%。最低检测限均为103copies/mL。结论 该体系可快速、有效、准确检测出样品中4种病原体的存在，可用于肠胃道相关病原体感染的辅助评价。

多重实时荧光PCR； 沙门菌； 志贺菌； 弯曲杆菌； 耶尔森菌

沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌是感染性腹泻的常见致病菌，可导致细菌性痢疾、食物中毒、伤寒等肠道传染病[1-2]。在我国，70%～80%细菌性食物中毒是由沙门菌引起的[3]。志贺菌是细菌性痢疾的主要病原体，人群普遍易感，全球每年约有100万人死于此病，在我国的发病率一直处于较高水平，尤其以婴儿和儿童更为易感[4-5]。弯曲杆菌广泛分布于自然界，可通过食物、水传播，其感染率近些年来在世界各地呈普遍上升趋势，在一些发达国家，弯曲杆菌感染引起的腹泻甚至超过了沙门菌和志贺菌，成为最常见的腹泻致病菌[6]。耶尔森菌是人兽共患性细菌，也是一种危害严重的食源性致病菌，在发达国家和发展中国家都有非常高的流行性。因此，建立快速、经济、灵敏、特异的检测方法对于疾病的防治具有十分重要的意义。

多重PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展的新型技术，可在同一体系同时扩增多个病原体核酸片段。目前国内外对病原体的研究已广泛采用多重PCR方法[7-9]，相较于常规的培养法、血清学方法，它更加方便、灵敏、省时，但国内研究中并未见这4种病原体同时检测的报道。本研究建立同时检测沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌的多重PCR方法，采用实时荧光TaqMan探针和双启动寡聚核苷酸(DPO)技术，有效提高扩增的特异性和扩增效率，结果判断实时、安全，达到快速准确同时检测沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌的目的，对于胃肠道菌群的鉴别检测具有很好的实用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、乳酸杆菌和双歧杆菌来自美国典型菌种保存中心(ATCC)。

1.2 标本来源 145份临床标本来源于郑州大学第一附属医院和河南科技大学第一附属医院。

1.3 仪器与试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen公司(QIAamp DNA Stool Kit)；分子生物学试剂、Taq DNA聚合酶、dNTP由华美生物工程有限公司提供；引物、探针由上海Invitrogen公司合成；PCR产物纯化试剂盒和T-A克隆试剂盒购自大连Takara公司；培养基购自英国Oxoid公司。ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国Lifetechnology公司。

1.4 方法

1.4.1 DPO引物和Taqman探针的设计 本体系中需同时检测4段目的基因，若采用普通引物，引物间极易形成二聚体，特异性低，且体系不易调配至适合所有目的基因的扩增。故本体系将采用退火温度范围宽且特异性强的DPO引物。检索GenBank中相关基因序列，做同源性对比后，最终选择在以下基因中选择各病原体的靶序列，见表1。并根据Chun等[9]来设计DPO引物，先确定短3′端，长度为6～15 bp，GC水平为40%～80%，反向延伸18～25 bp为其5′端，Tm>65 ℃。在其中序列设计出相应的Taqman探针，并以不同荧光标记区分，序列见表2。

表1 各病原体引物的靶基因

表2 DPO引物和探针设计结果

1.4.2 质粒标准品的构建 将已知阳性目的菌培养物用细菌DNA提取试剂提取DNA，并以其为模板进行常规PCR扩增，产物用PCR产物纯化试剂盒和T-A克隆试剂盒分别回收目的扩增片段，并将其克隆入pMD19-T载体中，转化于大肠杆菌JM109感受态细胞中，培养后收集菌体，碱变性法提取质粒，然后由上海Invitrogen公司测序。

1.4.3 样本的制备 培养物：将培养物转移至生理盐水中，5 000 r/mim离心10 min，弃上清液后溶解于200 μL生理盐水中，按DNA提取试剂盒说明书步骤提取DNA。临床标本：收集的粪便标本置-20 ℃保存待用。处理及DNA提取均按核酸提取试剂盒说明书步骤进行。收集洗脱体积为50 μL，10 μL用于PCR扩增。

1.4.4 PCR扩增体系设定 PCR扩增试剂采用一步法预混试剂，反应体系共25 μL，包括：2×PCR Buffer 12.5 μL(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3，100 mmol/L KCl,6 mmol/L MgCl2,0.002%明胶，400 μmol/L dNTPs)，5 μmol/L各引物探针混合物 1.5 μL，2 U Taq DNA聚合酶1.0 μL，待测样品10 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，40个循环步骤包括95 ℃变性8 s，60 ℃退火和延伸34 s。

1.4.5 结果判定 反应结束后，根据荧光图谱确定各目的基因的基线和阈值，所有阴性对照曲线低于阈值线，样本扩增曲线与阈值线的交叉值记录样本的Ct值，若反应曲线呈对数增长，而且Ct<33，则表明为阳性，否则判为阴性。

2 结 果

2.1 特异性

2.1.1 引物和探针 引物与探针经过BLAST检索，具有针对病原体唯一性。

2.1.2 培养物检测 (1)将肠道正常菌群(乳酸杆菌、双歧杆菌)培养物(4种目标菌阴性)进行特异性评价，用本体系引物探针分析，均无荧光扩增信号(图1)。显示特异性良好。(2)分别采用已知沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌或小肠结肠炎耶尔森菌阳性的培养物材料进行分析，扩增显示单一条带，所有阳性结果符合(图2)。(3)将4种菌培养产物随机2种、3种等量混合，取样品抽提DNA后，用本体系引物探针分析，所有阳性、阴性符合(图3、4)。(4)将4种菌培养产物等量混合，取样品抽提DNA后，用本体系引物探针分析，所有阳性符合，显示4条荧光扩增信号，且曲线形态标准、平滑(图5)。

图1 阴性样本检测荧光图谱表3 质粒最低检出量(Ct)

病原体106copies/mL105copies/mL104copies/mL103copies/mL沙门菌22.4625.7429.1832.20志贺菌22.6925.9429.3132.53弯曲杆菌22.6725.4728.8232.46耶尔森菌23.0125.7928.8733.05

图2 弯曲杆菌样本检测荧光图谱

图3 弯曲杆菌和沙门菌混合样本检测荧光图谱

图4 沙门菌、志贺菌、耶尔森菌混合样本检测荧光图谱

图5 4种病原体混合样品检测荧光图谱

2.2 灵敏度 最低检出量采用已知浓度质粒DNA进行梯度稀释(102～109copies/mL)来确定，检测最低4个稀释度重复10次，最低检出量均为103copies/mL，见表3。

2.3 标准曲线 多重PCR体系检测标准品质粒稀释度线性范围103～106copies/mL。r2>0.97,重复性好，各项参数均在偏差范围内。各质粒标准曲线参数见表4。

2.4 临床标本检测 145份临床标本分别用培养法和多重实时荧光PCR法进行检测，沙门菌和弯曲杆菌的特异性和敏感度都是100.0%，志贺菌和耶尔森菌的敏感度是100.0%，特异性分别是99.3%和98.6%。

表4 各病原体质粒标准曲线参数

3 讨 论

细菌性肠胃炎是临床最常见的疾病，每年夏、秋季是其发作的高峰期，由于温度、湿度大，食物易腐败、变质，导致细菌极易欺辱肠胃，临床表现多为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热等。临床鉴别是哪种细菌感染需做细菌培养、生化检测、血清鉴定等，至少需24 h才能得到结果。而多重实时荧光PCR可实现一管多检，可缩短检测时间至3 h，大大提高了检测效率。但多重PCR体系中难以克服的问题是，多引物间会形成二聚体，与单重PCR相比，引物与模板的错配概率大大增加。双启动寡核苷酸技术是将PCR引物分为两段独立的特异性区域，中间由寡聚次黄嘌呤碱基进行桥接，增强了引物间的兼容性，减少非特异性，能有效地提高PCR反应的敏感度与特异性，还可极大提高扩增效率[10]。

本研究所建立的多重实时荧光PCR体系，4种细菌质粒的最低检测限为103copies/mL；扩增效率为99%～110%；回归系数接近1.00；相较于同类方法文献[11-12]数据一致，结果可靠。特定细菌组合检测未有非特异性结果产生；经临床标本验证，与金标准培养法相比，沙门菌和弯曲杆菌检测的特异性都为100.0%，志贺菌为99.3%，耶尔森菌为98.6%，阳性检出率高于培养法，灵敏度为100.0%。该方法的优势在于它不同于常规PCR扩增，不需要进行反应后凝胶电泳分析，在反应进行中即可通过特定标记荧光值实时监测反应情况，可避免开管检测，有效降低污染风险；同时敏感度高、特异性好、检测耗时短的特点，使得操作更加简便、直观、安全、可靠。该方法的应用将有助于临床上快速鉴别特定细菌感染，进行针对性防治，使得其临床应用前景十分广阔，为多重实时荧光PCR方法在细菌性肠胃炎检测的商品化奠定了良好的基础。

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Establishment of multiplex real-time fluorescence PCR for Salmonella,Shigella,Campylobacter and Yersinia enterocolitica basing on dual priming oligonucleotide system*

LIANGHong,LIMing,JIAXin,XUJun-qiang

(Sino-AmericanBiotechnologyCo.,Ltd.，Luoyang，He′nan471003，China)

Objective To establish a multiplex real-time fluorescence PCR assay for simultaneously detecting Salmonella,Shigella,Campylobacter and Yersinia enterocolitica.Methods Dual priming oligonucleotide(DPO) was designed for these four pathogens.A multiplex RT-PCR assay system was developed using DPO primers.Results The specific DNA fragments of 4 kinds of pathogen were amplified simultaneously and specifically by this established PCR assay system.The specificity and sensitivity of the assay for detecting Salmonella and Campylobacter all were 100.0%,the sensitivities for detecting Shigella and Yersinia enterocolitica were 100.0% and the specificities were 99.3% and 98.6% respectively.The limit of detection(LOD) was 103copies/mL.Conclusion This multiplex RT-PCR system can detect the existence of these four kinds of pathogen rapidly,effectively and accurately and can be used the auxiliary evaluation of gastrointestinal related pathogen infection.

multiplex real-time PCR; Salmonella; Shigella; Campylobacter; Yersinia enterocolitica

河南省洛阳市科技发展计划项目(1301068A)。

梁红，女，本科，高级工程师，主要从事分子诊断研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.011

A

1672-9455(2015)20-2997-03

2015-02-15

2015-05-05)