慢性肾病患者抗氧化低密度脂蛋白抗体水平与炎性细胞因子表达的相关性研究

赖钰明，张 琴

(四川省绵阳市三台县医院肾脏内科 621100)



·论 著·

慢性肾病患者抗氧化低密度脂蛋白抗体水平与炎性细胞因子表达的相关性研究

赖钰明，张 琴△

(四川省绵阳市三台县医院肾脏内科 621100)

目的 探讨慢性肾病患者抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)抗体水平与炎性细胞因子表达的相关性。方法 收集慢性肾病患者50例，以及健康体检者10例(对照组)作为研究对象。检测研究对象血浆抗ox-LDL抗体水平，根据检测结果将慢性肾病患者分为高滴度组(抗ox-LDL抗体滴度≥23 μg/mL，n=21)和低滴度组(抗ox-LDL抗体滴度<23 μg/mL，n=29)，比较各组炎性细胞因子[干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-12]基因表达水平。结果 与对照组相比，高滴度组和低滴度组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均明显升高(P<0.05)。低滴度组IL-6和IL-10较对照组有明显升高(P<0.05)，但高滴度组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；高滴度组和低滴度组IL-12水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 慢性肾病患者血中抗ox-LDL抗体升高程度与多个炎性因细胞子表达水平具有一定相关性，检测慢性肾病患者血中抗ox-LDL抗体水平对了解疾病进程有重要的临床价值。

慢性肾病； 氧化低密度脂蛋白； 细胞因子

血脂异常多见于免疫低下患者，如肾移植和骨髓移植患者，且他们更易出现动脉粥样硬化[1]。研究表明，在免疫抑制患者中，心血管疾病导致的病死率高出健康人群10倍，其中氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在急性心肌梗死中表达上调，由ox-LDL引发的动脉粥样硬化是导致内源性功能失调的关键因素[2]。ox-LDL通过多种生物学活性引发动脉粥样硬化，包括影响一氧化氮合成、活化T淋巴细胞、诱导促粥样化效应因子表达，同时ox-LDL可活化单核细胞并诱导转化生长因子β(TGF-β)上调，促进疾病进展[3]。

细胞因子在慢性肾病发生和发展中起重要作用，研究表明，慢性肾病患者血清白细胞介素(IL)-6水平明显高于健康人，同时血清白细胞介素(IL)-8、IL-10和IL-18水平也明显高于健康人，表明细胞因子在慢性肾病患者疾病进程中有重要作用[4]。目前关于ox-LDL的研究多集中于器官移植患者和肿瘤患者中，而慢性肾病患者中抗ox-LDL抗体阳性水平与炎性细胞因子的相关性研究较少。本研究选取50例慢性肾病患者作为研究对象，并以健康成年人作为对照，研究血浆抗ox-LDL抗体水平与炎性细胞因子[干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12]表达的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年6月至2013年5月在本院确诊为慢性肾病的患者50例，以及10例健康体检者(对照组)作为研究对象。抽取患者和健康对照者抗凝血2 mL，1 500 r/min离心5 min分离血浆，于4 ℃保存待测。

1.2 方法

1.2.1 血浆抗ox-LDL抗体检测 检测试剂盒购自上海研吉生物有限公司(货号 DRE10046)。(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设10个标准品孔，按试剂盒说明书进行倍比稀释(稀释浓度分别为180、120、60、30、15 μg/L)。(2)加样：分别设空白对照孔和待测样品空，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板的待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL。(3)温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。(4)加酶：除空白对照孔外，每孔加入酶标试剂50 μL。(5)显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，37 ℃避光显色15 min。(10)终止：每孔加终止液50 μL，终止反应(此时蓝色立刻转为黄色)。(11)测定：以空白对照孔调零，检测450 nm波长下各孔的吸光度(OD)，测定应在加入终止液后15 min以内进行。

1.2.2 RNA提取 采用Trizol法提取RNA：(1)在细胞中加入1 mL Trizol试剂，15～30 ℃下静置5 min后加入0.2 mL氯仿；(2)室温静置3 min后，12 000×g离心15 min，弃上清液并加入0.5 mL异丙醇；(3)室温静置10 min后，12 000×g离心10 min，弃上清液并加入75%乙醇，12 000×g离心5 min；(4)弃上清液，空气干燥后，加入100 μL灭菌后的超纯水溶解。

1.2.3 PCR检测 反转录试剂盒试剂盒(FSQ101)购自北京天根生物公司以完成cDNA合成，反转录PCR条件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。定量PCR试剂盒购自北京天根生物公司(FP202)，PCR条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。共40个循环；55～95 ℃采集熔解曲线。扩增反应采用贝克曼定量PCR仪完成。PCR扩增引物见表1，其中3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。定量PCR结果采用Bio-Rad iQ5软件进行分析，按照文献采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析[7]。

表1 PCR扩增引物

2 结 果

2.1 各组研究对象一般资料比较 本研究共纳入慢性肾病患者50例，按照抗ox-LDL抗体滴度将其分为高滴度组(抗ox-LDL抗体滴度≥23 μg/mL，n=21)和低滴度组(抗ox-LDL抗体滴度<23 μg/mL，n=29)。高滴度组中性粒细胞水平较低滴度组及对照组略有升高，淋巴细胞则降低，其他指标无明显差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组研究对象一般资料比较±s)

2.2 慢性肾病患者中炎性细胞因子基因表达变化 与对照组相比，高滴度组和低滴度组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均明显升高(P<0.05)。低滴度组IL-6和IL-10较对照组有明显升高(P<0.05)，但高滴度组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；高滴度组和低滴度组IL-12水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图1 各组炎性细胞因子基因表达情况

3 讨 论

慢性肾病的发病率呈逐步上升趋势，该病具有进展迅速、筛查手段匮乏等特点，如未及时治疗，将迅速发展至终末期肾衰，并可导致心血管疾病等多种严重并发症。传统诊断方法常以血肌酐和蛋白尿作为监测肾功能的指标，但这2项指标的缺点在于难以准确反映肾脏受损程度[5]。目前已发现多个与慢性肾病发生、发展密切相关的生物学标志物，如胱抑素C、不对称二甲基精氨酸、肝型脂肪酸结合蛋白，以及与心血病并发症相关的标志物，包括心肌肌钙蛋白、脑钠肽、C反应蛋白、脂联素等，均在慢性肾病早期诊断中显示出良好的应用前景[6]。

ox-LDL是导致血脂异常及心血管疾病的重要因子之一，其致病机制为单核细胞分泌多个趋化因子，在活性氧参与下氧化为ox-LDL；同时还通过上调内皮细胞因子，增加血小板聚集影响凝血系统，从而促进心血管疾病进展。ox-LDL还通过细胞毒性作用，加速血液单核细胞进入内膜使细胞损伤加剧。血浆ox-LDL水平升高可增加动脉壁基质表达，促进动脉粥样硬化发生；ox-LDL还可通过直接或间接灭活一氧化氮的作用使内皮细胞功能调节异常[7]。但ox-LDL在慢性肾病中的研究还较少，对其在慢性肾病发生、发展中的作用也尚未清楚。

IL-6、IL-8和IL-10等炎性细胞因子主要由单核或巨噬细胞产生，是参与机体炎性反应和一系列生理过程的重要因子。刘从江等[8]研究表明，慢性肾病患者IL-6、IL-8、IL-10、IL-18的基因表达水平明显高于对照组，其机制是由于肾组织内炎性细胞浸润、多种细胞因子及氧自由基等共同作用从而引起肾组织结构受损。范广忠等[9]研究也发现，IL-6、IL-8、TNF-α等炎性细胞因子在早期糖尿病肾病患者中的表达水平明显升高，表明炎性细胞因子在慢性肾病的病理进程中有重要作用。本研究选取50例慢性肾病患者进行血清抗ox-LDL抗体检测，并根据检测结果将患者分为高滴度组和低滴度组，用定量PCR法检测患者多个炎性细胞因子的基因表达情况，结果提示抗ox-LDL抗体滴度升高似乎在慢性肾病患者中是一种保护性因素，可延缓炎性反应的发生。Yang等[10]研究也发现，血浆ox-LDL水平变化与白血病患者的多个细胞因子和趋化因子的表达呈明显负相关。但根据本研究结果就下此结论为时过早，在后续研究中将根据ox-LDL血浆水平并结合炎性细胞因子水平，监测患者病情进展及其对治疗效果和预后的影响，并根据临床队列研究得出ox-LDL与肾病进展的相关性，从而指导临床实践。

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Correlation study between the anti-ox-LDL antibody level and cytokine expression in patients with chronic kidney disease

LAIYu-ming,ZHANGQin△

(DepartmentofNephrology,CountyHospitalofSantai,Mianyang,Sichuan621100,China)

Objective To explore the relationship of the anti-ox-LDL antibody level and cytokine expression in patients with chronic kidney disease.Methods 50 cases of patients with chronic kidney disease were enrolled,and 10 healthy people were selected as control group.The plasma levels of anti-ox-LDL antibody were detected.According to the results,the patients with chronic kidney disease were divided into high titer group (anti-ox-LDL antibody≥23 μg/mL，n=21) and low titer group (anti-ox-LDL antibody<23 μg/mL，n=29).The gene expression levels of inflammatory cytokines (IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IL-6,IL-10 and IL-12) in each group were compared.Results Comparing with control group,the levels of IFN-α,IFN-β and IFN-γsignificantly increased in both high titer group and low titer group (P<0.05).The levels of IL-6 and IL-10 of low titer group were significantly higher than control group (P<0.05),however,those of high titer group were not significantly different from control group (P>0.05).The IL-12 levels of higher titer group and low titer group were significantly lower than that of control group (P<0.05).Conclusion The increase of anti-ox-LDL antibody in patients with chronic kidney disease related with the expression of many inflammatory cytokines.The detection of anti-ox-LDL antibody was important to understand the progression of chronic kidney disease.

chronic renal disease; oxdidatively modified low-density lipoprotein; cytokine

赖钰明，男，本科，主治医师，主要从事肾脏疾病诊治及血液透析血管通路研究。△

，E-mail：15228711845@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.041

A

1672-9455(2015)20-3075-03

2015-05-15

2015-08-10)