不同保存时间对血浆标本中人巨细胞病毒载量的影响

张 玲，张清禄

(陕西省渭南市中心医院检验科 714000)



·论 著·

不同保存时间对血浆标本中人巨细胞病毒载量的影响

张 玲，张清禄

(陕西省渭南市中心医院检验科 714000)

目的 研究4 ℃条件下存放30 d后血浆中人巨细胞病毒DNA的稳定性。方法 选择进行造血干细胞移植的150例患者的血浆标本，将其按照人巨细胞病毒DNA载量分为3组：低载量组(n=50,人巨细胞病毒DNA载量为300～1 000 copy/mL)、中载量组(n=50，人巨细胞病毒DNA载量为>1 000～10 000 copy/mL)和高载量组(n=50，人巨细胞病毒DNA载量为>10 000～100 000 copy/mL)。标本采集后2 h内完成基线载量(0 d)检测，其余血浆在4 ℃条件下保存，分别在保存1、2、3、7、14、21、30 d时检测人巨细胞病毒载量。结果 低、中、高载量组标本在保存1、2、3、7、14、21、30 d后，其人巨细胞病毒载量与0 d结果比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 血浆标本在4 ℃条件下存放30 d对人巨细胞病毒载量检测结果无影响。

保存时间； 血浆； 标本； 人巨细胞病毒

人巨细胞病毒实质是一种有包膜的双链DNA病毒，是疱疹病毒科β属。人巨细胞由220～245 kb的基因组成，直径约200 nm[1]。它是人类先天性病毒感染的主要病原体，在人群中的感染率极高，是器官移植、艾滋病患者等免疫力低下人群常见的感染和死亡原因[2-6]。由于患者发生人巨细胞病毒感染后无明显临床症状，或者其所致的疾病症状没有特异性，因此人巨细胞病毒感染必须依靠实验室诊断。目前临床上常用的人巨细胞诊断方法为病毒抗原检测、病毒分离培养、病毒核酸检测和特异性抗体检测[7-8]。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测可以及时反映人巨细胞病毒的活动状态，所以使用范围最广。目前，专家对不同标本保存温度和保存时间对人巨细胞病毒DNA稳定性的影响意见不一[9-10]。本研究选取2013年9月至2014年9月在本院进行造血干细胞移植的150例患者的血浆标本，研究4 ℃条件下保存30 d后血浆中人巨细胞病毒DNA 的稳定性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年9月至2014年9月在本院进行造血干细胞移植的150例患者的血浆标本。150例患者中，急性淋巴细胞性白血病38例，急性髓系细胞白血病40例，慢性粒细胞白血病34例，多发性骨髓瘤11例，骨髓增生异常综合征10例，非霍奇金淋巴瘤8例，其他血液病9例；男性86例，女性64例，年龄3～50岁，平均(22.38±2.57)岁。

1.2 分组方法 将所获血浆标本按照人巨细胞病毒的DNA载量分为3组：低载量组(300～1 000 copy/mL)，327～948 copy/mL,平均714 copy/mL，共50份标本；中载量组(>1 000～10 000 copy/mL)，1 027～8 927 copy/mL，平均4 873 copy/mL，共50份标本；高载量组(>10 000～100 000 copy/mL)，23 802～92 749 copy/mL，平均57 426 copy/mL，共50份标本。

1.3 RT-PCR 将采集的血液标本分别进行编号，放置于含EDTA的抗凝管(江西精致科技有限公司提供)中，立即送检，700×g离心10 min，离心后取1 mL无溶血的血浆标本进行RT-PCR检测，其余血浆标本置于4 ℃保存，分别在保存1、2、3、4、7、14、21、30 d时进行RT-PCR检测，每次检测前都要进行离心去除杂质。使用人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司提供)进行核酸提取及RT-PCR检测。将50 μL提取液与50 μL血浆混合均匀，100 ℃保温10 min，1 200 r/min离心5 min，取上层清液5 μL进行PCR扩增，扩增条件：93 ℃预变性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，循环10次，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，循环30次，在退火阶段监测荧光。每次检测都包含空白对照、阳性对照和阴性对照，判断是否存在PCR抑制和假阳性结果。所有标本由相同的实验人员在相同的实验条件下进行，实验室保持在22～25 ℃，相对湿度(65±5)%。

2 结 果

所有150份标本均被成功检测，RT-PCR检测过程中无抑制和假阳性现象出现。各组标本在保存1、2、3、7、14、21、30 d后，人巨细胞病毒载量与0 d时比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同标本保存时间人巨细胞病毒载量

3 讨 论

RT-PCR具有快速、敏感的特点，是常用的人巨细胞病毒检测方法。但我国仍存在很多不具有病毒DNA检测能力的实验室，在接受造血干细胞移植后，只能将受试者的血液标本送至其他病毒学实验室进行检测。因此，如何优化血液标本的采集、处理和保存，以保证人巨细胞病毒载量的检测结果就显得尤为重要[10]。多数在本院进行移植的患者初次人巨细胞病毒载量检测结果为300～100 000 copy/mL。因此，本研究选取2010年9月至2014年9月在本院进行造血干细胞移植的150例患者的血浆标本(人巨细胞病毒载量为300～100 000 copy/mL)进行DNA稳定性分析。

本研究结果显示，低、中、高载量组标本保存1、2、3、7、14、21、30 d后，其病毒载量与保存0 d时的检测结果比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。Abdul-Ali等[11]研究结果显示，血浆标本保存14 d后其中的人巨细胞病毒载量无明显变化，与本文结果相似，但其所用的标本中有一半为阴性血浆稀释后的标本，而且基线人巨细胞病毒载量并非真正的第0天的结果，而是放置几天后的结果。本研究不仅选取标本有高、中、低3种不同载量的标本，还做到了在标本采集后2 h内立即获取基线人巨细胞病毒载量。Schafer等[12]研究显示，人巨细胞病毒PCR结果的假阳性会因血液标本的延时处理而增高。因此，本次研究过程中每次测试前都对标本进行离心处理，以此来确保RT-PCR检测的准确性。30 d并非研究核酸稳定性的最长时间，Baleriola等[13]的研究中曾检验标本在-70～-20 ℃条件下保存9年后HBV、HIV、HCV载量的变化，发现病毒载量的改变对临床判断的影响极小。但是用于治疗的生物制品中的人巨细胞病毒在保存1、5年后其载量是否有明显变化，仍需大样本的实验进一步研究，评估更长标本保存时间的人巨细胞病毒DNA的稳定性。由本研究结果可见，对于进行人巨细胞病毒载量检测的血浆标本，如果不能当天完成检测,则可以在30 d内完成检测；对于需要复检的临床结果，可以在排除不可预测的血浆因素后，在30 d内重复检测；各实验室应针对自身条件优化对临床标本的保存条件。

综上所述，血浆标本在4 ℃条件下保存30 d，不影响人巨细胞病毒载量的检测结果。

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Influence of different storage time on giant cell viral load in plasma specimen

ZHANGLing,ZHANGQing-lu

(DepartmentofClinicalLaboratory,WeinanMunicipalCentralHospital,Weinan,Shaanxi714000,China)

Objective To study the stability of cytomegalovirus(CMV) DNA in plasma after 30 d storage under 4 ℃.Methods The plasma samples from 150 patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation were selected and divided into 3 groups according to DNA loads of human CMV:low load group(n=50,CMV DNA loads 300-1 000 copy/mL),middle load group(n=50,CMV DNA load 1 000-10 000 copy/mL) and high loads group(n=50,CMV DNA loads 10 000-100 000 copy/mL).The base line load(0 d) detection was completed within 2 d after sample collection,the other palasma was stored under the condition of 4 ℃.The human CMV load was detected on 1,2,3,7,14,30 d storage.Results The 150 samples were matched for different time points,cytomegalovirus loads of 1,2,3,7,14,21,30 days compared with baseline,the difference had no statistical significance(P>0.05).Conclusion The plasma sample after 30 d storage under 4 ℃ has no influence on the detection results of CMV load.

storage time; plasma; sample; human cytomegalovirus

张玲，女，本科，主管检验师，主要从事临床检验研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.042

A

1672-9455(2015)20-3078-02

2015-03-25

2015-07-15)