不同剂量桃仁提取物对急性胰腺炎大鼠肠道黏膜屏障功能及免疫功能的作用①

兰 涛 李志娟 付立平 赵江桥 陈 辉

(河北省沧州市人民医院普外二科，沧州 061000)

重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是腹部外科常见的急腹症，其起病急、病程进展快、并发症多、治疗棘手、死亡率高，占整个急性胰腺炎的10%～20%［1］。SAP 常伴有肠黏膜免疫屏障功能损伤，造成肠道细菌及内毒素直接进入腹腔、血液循环、淋巴系统，引起多种免疫炎症介质的失控性“瀑布样”释放从而导致全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能不全综合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是SAP 致死的主要原因之一［2］。随着研究的深入，炎症免疫功能紊乱在SAP 疾病发生发展过程中的作用逐渐被认识，免疫平衡的重要性在SAP 的治疗中已逐渐受到关注［3］。桃仁为蔷薇科植物Prunus persica(L)Batsch 及山桃Prunus davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟种子，具有镇咳平喘、扩张血管、防止动脉粥样硬化、抗血小板聚集、抗肝纤维化、抗癌及抗衰老等作用［4］。本课题组前期研究显示，桃仁提取物(Persicae semen extract，PSE)对SAP 具有一定治疗作用，本研究对桃仁提取物对SAP 大鼠的免疫功能和免疫屏障作用进行研究，为进一步扩大桃仁在临床的应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 药物 桃仁由本院中药房提供。取桃仁500 g，用10 倍量蒸馏水在水浴上回流提取2 次，每次2 h，合并滤液，用旋转蒸发仪处理，水浴浓缩成浸膏，120 mg 相当于1 g 生药，备用，临用时用蒸馏水配制成所需浓度。

1.2 动物 SPF 级健康SD 大鼠60 只，体重(250±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.3 主要试剂 牛磺胆酸钠、D-乳酸标准液及右旋乳酸脱氢酶，由美国Sigma 公司提供;淀粉酶测定试剂盒、二胺氧化酶试剂盒均由南京建成有限公司提供;分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A，sIgA)ELISA 试剂盒由南京建成科技有限公司提供;Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD8 PE、Anti-Rat CD25 PE 均由美国eBioscience 公司提供;红细胞裂解液，由美国BD Pharmingen 公司提供;IgA、IgM 和IgG 试剂盒均由北京华英生物技术研究所提供;Trizol 试剂盒由美国Invitrogen 公司提供;Taq DNA聚合酶、dNTP 和模板DNA，均由武汉天维时代生物制品公司提供;SYBR Green PCR Reagents 由美国ABI 公司提供。

1.4 主要仪器 FACSAria Ⅲ型流式细胞仪由美国BD 公司提供;全自动生化分析仪由日本Olymous 提供;Spectrum Lab 22 PC 型分光光度计由上海棱光技术有限公司提供;EXL808 全自动酶标仪由美国Bio-Tek 提供;ABI 7500 Real-time PCR System 由美国ABI 公司提供。

1.5 SAP 造模 每只大鼠应用10%水合氯醛0.33 ml/100 g 进行麻醉，上腹正中切口，暴露胆胰管，在肝门处用无损伤显微血管夹夹闭胆胰管，用胰岛素注射针由十二指肠前壁斜行进针，经乳头部插入胆胰管，以0.1 ml/min 的速度匀速向胆胰管内注入3%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)。约10～15 min 胰腺出现肉眼可见的水肿出血。表明SAP 模型制作成功，松开血管夹，缝合关闭腹腔。所有大鼠术后均自由饮水饮食。

1.6 动物分组及干预 将48 只大鼠进行SAP 造模，造模后随机分为模型对照组、桃仁提取物低剂量、中剂量和高剂量组，每组12 只。其余12 只大鼠作为假手术组，假手术组开腹后仅翻动肠管和胆胰管。造模后麻醉苏醒即开始干预，桃仁提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃给予桃仁提取物0.12、0.248 和0.36 g/kg(分别相当于药材1、2和4 g/kg)，假手术组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃，各组灌胃均1 次/6 h，连续4 次。

1.7 检测指标及方法 给药后24 h 应用10%水合氯醛麻醉各组大鼠，打开胸腔和腹腔，腹主动脉分别抽取5 ml 血样于EDTA 抗凝管和非抗凝管内，分别应用荧光直接标记法和流式细胞仪进行CD4+、CD8+和Treg 细胞测定以及采用放射免疫法测定血清IgA、IgM 和IgG，采用EPS-G7 底物法测定血清淀粉酶水平，采用酶学分光光度法检测血清D-乳酸水平，采用活性比色法测定血清二胺氧化酶。取小肠组织进行光学显微镜检查病理学改变，采用放射免疫法进行sIgA 测定以及采用RT-PCR 法进行TLR4和NF-κBp65 mRNA 测定。

1.7.1 血液CD4+、CD8+和Treg 细胞的测定 取抗凝血100 μl 加入流式测定管中，分别加入5 μl Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD8 PE、Anti-Rat CD25 PE混匀，避光常温下孵育约15 min，加2 ml 溶血素，避光孵育约10 min，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加PBS 洗2 遍，弃上清液，加入PBS 缓冲液，调整细胞浓度至1×106个/ml，于流式细胞仪分析。采用Cell Quest 软件分析数据，CD4+-FITC/CD25+-PE均标记上的细胞为阳性细胞，阳性细胞与淋巴细胞之比为Treg 细胞百分数。

1.7.2 血清IgA、IgG、IgM、淀粉酶、D 乳酸和二胺氧化酶的测定 非抗凝采血管血样室温静置30 min，待血液完全凝固后离心分离得血清样本，放入-20℃冰箱保存备检。取待测血清，采用免疫比浊法测定IgA、IgG 和IgM，采用EPS-G7 底物法测定血清淀粉酶水平，采用酶学分光光度法检测血清D-乳酸水平，采用活性比色法测定血清二胺氧化酶。操作严格按照说明书规定进行。

1.7.3 小肠病理学改变的观察 取2 cm 小肠组织，经生理盐水轻柔冲洗肠腔，用4%多聚甲醛进行固定，石蜡进行包埋、切片、苏木精和曙红进行染色(HE 染色)，光学显微镜进行观察。

1.7.4 小肠黏膜中sIgA 的测定 小肠末端经生理盐水冲洗肠腔，取肠黏膜0.5 g，加生理盐水0.5 ml，低温匀浆，3 000 r/min 低温离心10 min，取上清液进行检测sIgA。取上清液0.1 ml，采用免疫放射法以全自动生化分析仪测定。操作严格按照说明书规定进行。

1.7.5 小肠组织TLR4 和NF-κBp65 mRNA 的测定 小肠末端经生理盐水冲洗肠腔，取小肠组织0.2 g采用Trizol 试剂盒一步法提取组织总RNA。取RNA 样品，用核酸分析仪进行定量，测定260 和280 nm 的吸光度(A)值，控制A260/A280 在1.9～2.1。取RNA 逆转录酶，按试剂盒说明操作合成cDNA。上海生工生物工程技术有限公司设计并合成引物，引物序列和产物长度见表1。取RNA 样品5 μl 于聚合酶链反应(PCR)反应管中，加入目的基因和βactin 引物各1.5 μl，Access QuickTMMaster Mix 12.5 μl，Nuclease-Free Water 3.5 μl，AMV Reverse Transcriptase 1 μl，构成25 μl 的反应体系。RT-PCR 反应条件为:逆转录45℃45 min，预变性95℃ 120 s，变性95℃20 s，退火58℃20 s，延伸72℃60 s，扩增25 个循环后延伸86℃10 s。使用基于内参物βactin 的相对定量分析，目的基因mRNA 表达量用2-ΔΔCt计算转录水平的差异。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0 软件进行数据分析，计量资料采用±s 表示，两组间采用独立样本t检验进行比较。P ＜0.05 为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量桃仁提取物对大鼠小肠组织病理学改变的影响 假手术组大鼠小肠黏膜无显著损伤;模型对照组大鼠小肠黏膜出现炎性细胞浸润，间质水肿，不规则绒毛，黏膜糜烂坏死，小肠上皮细胞脱落、坏死。低剂量组大鼠小肠黏膜病理情况与模型组基本相似，中剂量和大剂量组大鼠小肠黏膜损伤显著降低。见图1。

2.2 不同剂量桃仁提取物对大鼠肠道黏膜屏障功能的影响 模型对照组大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、和二胺氧化酶水平均较假手术对照组大鼠显著升高(P＜0.01)，小肠黏膜sIgA 较假手术对照组显著降低(P＜0.01)。桃仁提取物低剂量组和模型组大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、二胺氧化酶和小肠黏膜sIgA差异均无统计学意义(P＞0.05)，中剂量和高剂量组大鼠血清淀粉酶、D-乳酸和二胺氧化酶水平均较低剂量组大鼠显著降低(P＜0.01)，小肠黏膜sIgA 较低剂量组显著升高(P＜0.01)，并且高剂量组和中剂量组差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.3 不同剂量桃仁提取物对血液CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 细胞的影响 模型组大鼠血液CD4+、CD4+/CD8+较假手术组大鼠显著降低(P ＜0.01)，CD8+、Treg 细胞较假手术组大鼠显著升高(P＜0.01)。桃仁提取物低剂量组大鼠血液CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 细胞与模型组大鼠差异均无统计学意义(P＞0.05)，中剂量和高剂量组血液CD4+、CD4+/CD8+较低剂量组大鼠显著升高(P ＜0.01)，CD8+、Treg 细胞较低剂量组大鼠显著降低(P＜0.01)，并且高剂量组和中剂量组大鼠异均具有统计学意义(P＜0.01)。结果见表3。

图1 各组大鼠小肠组织病理学改变的比较Fig.1 Comparison of pathological changes of small intestine in different group of rats

2.4 不同剂量桃仁提取物对血清IgA、IgG和IgM的影响 模型组大鼠血清IgA、IgG、IgM 较假手术组大鼠显著降低(P＜0.01)。桃仁提取物低剂量组大鼠血清IgA、IgG、IgM 与模型组大鼠差异均无统计学意义(P＞0.05)，中剂量和高剂量组血清IgA、IgG、IgM 较低剂量组大鼠显著升高(P＜0.01)，并且高剂量组和中剂量组差异均具有统计学意义(P＜0.01)。结果见表4。

表1 引物序列及RT-PCR 产物长度Tab.1 Sequence of primer and length of RT-PCR products

2.5 不同剂量桃仁提取物对小肠组织TLR4 和NFκBp65 mRNA 的影响 模型组大鼠小肠组织TLR4和NF-κBp65 mRNA 较假手术组大鼠显著升高(P＜0.01)。桃仁提取物低剂量组小肠组织TLR4 和NF-κBp65 mRNA 与模型组大鼠差异均无统计学意义(P＞0.05)，中剂量和高剂量组小肠组织TLR4 和NF-κBp65 mRNA 较低剂量组大鼠显著降低(P ＜0.01)，并且高剂量组和中剂量组差异均具有统计学意义(P＜0.01)。结果见表5。

表2 各组大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、二胺氧化酶和小肠黏膜sIgA 的比较(n=12)Tab.2 Comparison of amylase，D-lactic acid，diamine oxidase in serum and sIgA in mucous membrane of small intestine in different group of rats (n=12)

表3 各组大鼠治疗后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 细胞的比较(n=12)Tab.3 Comparison of CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ and Treg cell in different group of rats (n=12)

表4 各组大鼠治疗后血清IgA、IgG 和IgM 的比较(n=12)Tab.4 Comparison of IgA，IgGand IgM in different group of rats (n=12)

表5 各组大鼠治疗后小肠黏膜sIgA 以及小肠组织TLR4和NF-κBp65 mRNA 的比较(n=12)Tab.5 Comparison of sIgA in intestinal mucosa，TLR4 and NF-κBp65 mRNA in intestinal tissue in different group of rats (n=12)

3 讨论

SAP 是外科最为凶险的急腹症之一，具有起病急、发展快、并发症多、预后差的特点。研究显示肠黏膜屏障功能的破坏是SAP 发生级联反应的关键点之一，肠黏膜屏障高通透性导致肠道细菌和内毒素易位，与SAP 时胰腺坏死组织继发细菌感染密切相关，是SAP 高致死率的主要原因［5］。桃仁是祖国医学活血化瘀要药，现代研究亦表明桃仁对心脑血管疾病疗效显著，近年来受到广泛关注。研究表明，桃仁提取物能改善不同病因所致大鼠的血液循环障碍［6］。但是，目前针对桃仁治疗急性胰腺炎的作用目前尚未有报道。

血清淀粉酶是急性胰腺炎诊断中最常用的生化标志物。D-乳酸是细菌发酵的代谢产物，当肠道通透性增加时大量D-乳酸通过受损黏膜入血［7］。二胺氧化酶是肠黏膜上层绒毛细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶，当肠黏膜细胞受损、坏死后该酶释放入血［8］。sIgA 是构成肠道免疫屏障功能的主要组成物质，研究表明［9］sIgA 分泌减少可降低肠道抵御细菌和毒素入侵的能力，并且易激活细胞炎性因子，产生过度炎性反应，进一步损害肠黏膜。桃仁提取物0.248g/kg 和0.36g/kg 可显著降低SAP 大鼠小肠黏膜病理损伤以及血清淀粉酶、D-乳酸和二胺氧化酶水平(P＜0.01)，并且增加小肠黏膜sIgA 水平(P＜0.01)，说明桃仁提取物可以通过降低肠道黏膜通透性、改善肠道免疫屏障功能而起到保护SAP 大鼠肠道黏膜的作用。

多数学者认为，SAP 患者细胞免疫功能低下是其发生感染并发症及死亡率高的原因。外周血T淋巴细胞及其亚群分析是公认的反映机体细胞免疫状态的较好指标。SAP 时外周血淋巴细胞总数及CD4+/CD8+比值下降与疾病的严重程度密切相关，上调CD4+/CD8+可增强细胞免疫功能［10］。本研究结果显示，桃仁提取物中剂量和高剂量组CD4+/CD8+比值较低剂量组显著升高(P＜0.01)，说明桃仁提取物可显著改善SAP 大鼠细胞免疫功能。此外，桃仁提取物中剂量和高剂量组IgG、IgA 和IgM水平较低剂量组显著升高(P＜0.01)，说明桃仁提取物也可改善SAP 大鼠的体液免疫功能。调节性T细胞(Regulation T cell，Treg)是近年来发现的一类具有独特负向免疫调控作用的T 细胞亚群，Treg 细胞水平一定程度上成为反映SAP 损伤严重程度的敏感指标［11］。本研究结果显示，桃仁提取物中剂量和高剂量组Treg 细胞水平较低剂量组显著降低(P＜0.01)，说明桃仁提取物可显著降低SAP 大鼠的Treg 细胞水平。

固有免疫是机体抵抗有害刺激的第一线，作为固有免疫的中心受体即Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族已成为研究SAP 发病机制的热点［12］。TLR4 是目前研究最多的TLRs，是先天性免疫的门户蛋白，TLR4 在SAP 的发病早期就参与了机体免疫反应最终触发的炎症级联反应，导致SAP恶化［13］。NF-κB 是一种前炎症介质基因核因子，也是一种具有转录调节作用的核蛋白，参与调控基因转录过程［14］。当TLRs 被外源性或者内源性配体激活后，通过一系列的信号级联激活NF-κB 转位进入胞核，启动诸多细胞因子和炎症介质基因的转录和翻译，激活多种与炎症有关的细胞因子、黏附分子，导致炎症反应的发生［15］。本研究结果显示，桃仁提取物0.248g/kg 和0.36g/kg 可显著降低SAP 大鼠小肠组织TLR4 和NF-κBp65 mRNA(P＜0.01)，说明桃仁提取物可抑制SAP 大鼠的TLR4/NF-κB 信号转导通路，并且作用具有剂量依赖性。

总之，桃仁提取物对急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能具有保护作用，并且显著改善急性胰腺炎大鼠的免疫功能。

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