黄曲霉毒素M1 免疫学检测方法研究进展①

陈 曦 侯玉泽 蔡齐超 胡骁飞 邓瑞广 (河南科技大学食品与生物工程学院，洛阳 471003)

黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是黄曲霉毒素的一种，是在动物摄入含有黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的饲料后，AFB1 在体内经羟基化所形成的代谢物。AFM1 主要存在于动物的乳汁中，在肝肾、肉、蛋以及尿液也有存在。随着人们生活水平的提高，乳及乳制品以其较高的营养价值深受消费者的喜爱。近年来，由于“蒙牛问题奶”、“光明奶粉碘超标”等食品安全事件的发生，AFM1 的污染问题引起了社会的广泛关注［1］。目前，黄曲霉毒素M1 快速灵敏的免疫学检测方法已成为国内外学者研究的热点。

1 黄曲霉毒素M1 概述

AFM1 属于黄曲霉毒素的一种，其基本结构为一个二呋喃环的氧杂萘邻酮，熔点299 ℃，形状为长方形片状，无色结晶，且可溶于多种有机溶剂，如氯仿、乙腈和甲醇等［2，3］。黄曲霉毒素M1 在365 nm的紫外线下可发出蓝紫色的荧光［4］。

黄曲霉毒素是目前发现的强致癌物之一，它的毒性高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，是氰化钾的5 倍，砒霜的40 倍［5-7］。哺乳动物摄入被AFB1污染的食品或饲料之后，在体内肝微粒体单氧化酶的催化下，通过细胞色素P450 的调节作用，末端呋喃环C-10 被羟基化就生成了AFM1［9］。研究发现，人类和乳牛摄入AFB1 后，在其乳汁中变成AFM1的转化率为0.3%～6.1%［10］。AFM1 毒性主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。陈振元［11］、邬少明［12］、涂文升［13］等研究人员通过对启东、扶绥等肝癌高发区的研究，发现肝癌的发病率与AFB1的摄入以及转化为AFM1 的转化率有密切关系。

近年来，AFM1 在乳及乳制品中的污染现象十分普遍。Rahimi 等［14］调查了150 份伊朗农场的乳样，其中包括60 份牛乳，42 份绵羊乳和48 份山羊乳。在分析的样品中，黄曲霉毒素M1 检出的概率是46.7%，平均浓度是(40.35±22.2)ng/L。在受污染的样品中，有37.5%的牛乳和5.9%的山羊乳中黄曲霉毒素M1 的含量高于50 ng/L。Zinedine等［15］用免疫亲和柱-荧光色谱法检测来自摩洛哥五个不同的生产乳制品的公司的54 个样品中的黄曲霉毒素M1 的含量。分析结果表明，在摩洛哥的受检样品中，88.8%的受检样本都受到了AFM1 污染，仅7.4%的受检样本低于0.05 μg/L。Dutton 等［16］分别对南非的九家奶牛场的生乳及成品牛乳进行了抽样，结果所有生乳均检出了黄曲霉毒素M1，绝大部分的成品牛乳中黄曲霉毒素M1 的含量超过0.05 μg/L。针对食品中AFM1 的污染问题及其强烈的毒性作用，部分国家和地区都制定了乳制品中AFM1 的限量标准(表1)，其中欧盟和日本对乳制品中AFM1 的限量标准要求最为严格。

表1 部分国家和地区AFM1 的限量标准Tab.1 Permissible limit of AFM1 in some countries and regions

为避免食品中AFM1 的污染对人体健康造成危害，针对食品中AFM1 的定性定量检测方法就显得尤为重要。传统检测方法有薄层层析色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。但是由于TLC 只能定性不能定量，而且所需时间长;HPLC 样品处理过程较为繁琐，仪器昂贵。所以，这两种方法在实际应用中都无法进行大范围推广。基于抗原抗体反应的免疫学检测方法具有灵敏性好、特异性强、操作简单等优点，可以进行现场大规模检测，能够得到很好的推广。近年来，随着学科间的相互渗透，免疫学检测方法涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。

2 酶联免疫吸附(ELISA)法

自1971 年Engvall［19］将ELISA 用于IgG 定量测定，使得酶标抗体技术逐步发展成液体标本中微量物质的测定方法。酶联免疫吸附法的原理是将抗体或完全抗原包被在固相载体上，测定时将待测样品和酶标抗原或抗体的混合物与固相载体表面吸附的抗体或抗原反应，再洗涤去除抗原抗体复合物或游离成分，然后加入酶作用底物，催化显色，最后加终止液终止反应［20，21］。ELISA 方法具有快速简便、特异性高、敏感性强、无需昂贵的仪器设备且对样品的纯度要求不高等优点，特别适应于大批样品的检测，在AFM1 的快速检测上有较高的应用价值。由于该方法对样品纯度要求不高，所以在试验中易产生假阳性现象，且受外在环境影响较大。

裴世春等［22］采用牛血清白蛋白与AFM1 偶联，制备人工抗原免疫BALB/c 小鼠，获得了特具有灵敏性高、特异性强的单克隆抗体，并利用此抗体建立间接竞争定量ELISA 方法，该方法的最低检出限是0.08 ng/ml，校正曲线的线性范围为0.04～5 ng/ml。Laura 等［23］发现了一种可半定量测定AFM1 的侧流装置，具有较高的灵敏度，最低检测限量为20 ng/L。Zhang 等［24］利用两步筛选法筛选出5 株具有抗黄曲霉毒素且亲和力高的通用细胞株，其中ICII细胞株亲和力最好，灵敏度最高，对AFM1 的最低检出限为13.2 pg/ml。Guan 等［25］利用半固体筛选法，筛选出抗AFM1 的细胞株，该细胞株的亲和力达到1.74×109L/mol 且与黄曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 都无交叉反应，利用此抗体建立了超灵敏的间接竞争酶联免疫吸附法，可检测牛奶及婴幼儿乳制品，检测限分别为3 和6 ng/L，将该方法应用于样品中检测，回收率在91%～110% 之间，变异系数小于10%，与标准的HPLC 比较，具有非常好的相关性。

3 电化学免疫传感器法

电化学免疫传感器是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原抗体反应的生物传感器，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点，已广泛地应用在临床各个领域［26］。电化学免疫传感器主要有竞争和非竞争两种模式来检测黄曲霉毒素。

竞争模式是将特异性的抗体或抗原-蛋白复合物固定在探针上。在竞争反应中，游离的酶-目标物复合物与目标物竞争结合探针上的抗体或抗原。最后根据酶催化氧化底物所产生电流的多少进行定量。Micheli 等［27］研制出AFM1 的检测探针，并对pH 值、每一个步骤的时间、温度的长度等参数进行了优化，得出AFM1 的最低检测限为25ppt。并与色谱法进行比较，得出电化学法具有更好的检测限和更短的分析时间。

非竞争模式是通过抗体—抗原复合物一步式免疫反应实现。抗原与抗体一酶复合物的结合，对电子探针产生阻碍导致电流发生变化。Parker 等［28］采用这种方法，测定牛奶中AFM1 的含量，得出的AFM1的检测范围为39～1 000 ng/L。与高效液相检测方法相比，灵敏度上是可以相媲美的，在便携性和成本上却是大大优于后者。Dinckaya 等［29］创建了一个检测黄曲霉毒素M1 的新的免疫传感器，以金纳米粒子为金电极，搭配半胱胺的单层膜，再加上探测器，组装成新的免疫传感器。该传感器检测黄曲霉毒素M1的范围为1～14 ng/ml，偏差为0.36 ng/ml。

4 免疫荧光法

免疫荧光技术就是将已知的抗原或抗体标记上荧光素或有荧光的物质制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。然后用荧光显微镜进行观察，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量［30］。该方法具有特异性强、灵敏度高、标准曲线范围宽、分析速度快、标记物制备较简便、有效使用期长、无放射性污染等优点。该方法一般与免疫层析配合使用，但是样品处理完全依赖免疫亲和柱，样品的提取液未经色谱柱分离，遇到复杂的基质样品或共存干扰物，可能会带来结果偏差。

王伟等［31］用荧光光度法测定高乳脂乳和乳制品中的黄曲霉毒素M1，该方法的检测限为0.1 μg/kg，相对标准偏差低于5%，回收率88%～93%。已经能够满足对进出口乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的检测。Beloglazova 等［32］用荧光标记技术定量测定牛奶中黄曲霉毒素M1，得到的最低检测限是0.014 μg/kg。而且假阳性和假阴性结果的比率分别为2.6%和3.3%，均低于5%。

5 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析技术就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物而发展起来的［33］。它在对样品的检测过程中，既不需要对样品进行分离纯化，也不需对样品检测溶剂做任何的前处理，方便、快捷。该技术现已广泛应用于研制各种胶体金免疫层析试纸条和试剂盒。但是，胶体金免疫层析试纸条和试剂盒一般保存时间有限，在常温下不能长久保存。

Wang 等［34］研制出一种用于检测乳及乳制品中AFM1 的纳米金免疫层析试纸条。在检测的15 种乳及乳制品中，有6 种乳及乳制品存在轻微的AFM1 污染，所有乳及乳制品中AFM1 均低于1 ng/ml。该试纸条的检测限为0.028 ng/ml，检测时间为10 min。孙翠萍等［35］利用胶体金免疫层析技术研制了一种快速检测牛奶中的AFM1 试纸条，经过测试，该试纸条的检测限为0.5 ng/ml，检测时间为10 min，假阳性率和假阴性率均为0，该方法准确，可靠，使用简便，适合大量样品的现场检测。

6 无毒检测法

在AFM1 检测过程中，必不可少的要使用到AFM1 标准品，而AFM1 毒性较强，很可能对实验人员以及环境造成危害，但是，噬菌体展示技术的出现可能为我们打开了另一扇门。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术［36］。熊啸等［37］以抗AFM1 的单克隆抗体为筛选配基，经过淘选，从噬菌体随机七肽库中筛选获得了与抗AFM1 单克隆抗体具有较高亲和性的阳性噬菌体克隆。也即是说，模拟的表位肽能够取代AFM1 进行反应，不仅保护了实验人员的健康，并且还能减少对环境的污染。

7 问题与展望

随着人们生活水平的日益提高，食品安全问题越来越受到重视，解决AFM1 可能造成的污染问题迫在眉睫，因此，针对AFM1 检测方法的研究就显得尤为重要。TLC 只能定性不能定量，且耗时长;HPLC 操作繁琐，仪器昂贵，且需要专业的人才，而免疫学检测方法因其操作简单，耗时较短，且灵敏度高，特异性好等优点被广泛的应用于实际生产中。ELISA 方法大大提高了AFM1 的检测效率，电化学免疫传感器法则是在ELISA 方法的基础上从技术上提高了检测AFM1 的灵敏度，免疫荧光法是在电化学免疫传感器法下加入荧光标记物，扩大了检测AFM1 的范围。胶体金免疫层析法就是在免疫荧光法的启发下，利用胶体金本身的显色特点结合ELISA 方法，使检测极限显著提高得同时缩短了检测时间。而应用噬菌体展示技术筛选毒素模拟表位肽，可减少AFM1 测定中所使用的AFM1 标准品对试验人员及环境的危害。因此，把ELISA 技术与胶体金技术及噬菌体展示技术相结合，用于测定各种对人类及环境可能有毒害作用的物质，必将成为一种趋势，且拥有十分广阔的前景。

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