5-氟尿嘧啶对人绒毛膜癌细胞株JAR作用的观察*

武警陕西省总队医院(西安710054) 庞苗苗 惠建荣 安瑞芳

5-氟尿嘧啶对人绒毛膜癌细胞株JAR作用的观察*

武警陕西省总队医院(西安710054) 庞苗苗 惠建荣△安瑞芳▲

目的：观察5-氟尿嘧啶(5-Fu)对人绒癌细胞株JAR的体外作用。方法：采用MTT比色分析法，观察20、50、100μg/L 3种剂量的5-Fu对人绒癌细胞株JAR细胞的生长抑制情况；通过免疫组化法检测3种浓度5-Fu作用于JAR细胞后增殖细胞核抗原Ki67的表达情况。结果：①5-Fu能抑制JAR细胞的生长，并在一定时间及浓度范围内,表现出剂量依赖性,72h内5-Fu浓度在25～100μg/L时抑制作用比较明显；②100μg/L的5-Fu作用于JAR细胞72h后细胞抑制率达73.19%,作用后增殖细胞核抗原Ki67明显下降。结论：①5-Fu对人绒癌细胞株JAR细胞的生长具有抑制作用,72h内呈剂量依赖性；②5-Fu抑制了人绒癌细胞株JAR细胞的增殖,细胞可能被阻滞于G0及G1期。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)作为一种抗代谢类化疗药物，已经被作为绒癌化疗一线药物。研究证实Ki67在多种实体恶性肿瘤中呈高表达，并且数值高低与宫颈癌、绒癌等妇科肿瘤的分化程度、浸润、转移以及预后密切相关[1-4]。本实验通过观察体外5-Fu对人绒癌细胞株JAR细胞的抑制作用，同时通过免疫组化检测用药后JAR细胞核增殖抗原Ki67的表达,探讨5-Fu对人绒癌细胞株JAR的体外作用。

材料和方法

1 材 料 人绒癌细胞株JAR(中科院上海细胞库)；5-Fu(美国Sigma公司)；Ki67兔抗人mAb(北京中山生物技术有限公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(四季青生物公司)；ABC免疫组化试剂盒(Dako公司)；日本BH-2型Olympus双筒显微镜及镜下组织摄像系统；紫外分析仪(北京六一仪器厂,WD-9403C型)；PM-10AD纤维摄像仪(上海医疗器械七厂)；低温烤箱(广州格兰士公司)等。

2 方 法 ①细胞培养：体外常规培养JAR细胞株,37℃,在50ml/L CO2培养箱中培养,培养液采用含100 ml/L(10%)胎牛血清的无菌高糖培养基(DMEM)。待细胞贴壁生长后用0.25%胰酶和EDTA消化液消化传代。②MTT比色分析法：收集处于对数生长期的JAR细胞,制成单细胞悬液,并用无菌高糖培养液调至细胞悬液浓度为1×105个/ml,之后取100μl,接种于96孔培养板中,预培养24h。24h后在实验组中加入3种不同浓度的5-Fu(25,50,100μg/L),阴性对照组不加5-Fu，空白对照组只加入培养液,每个组设6个复孔，各组分别在加药后72h加入5g/L四甲基偶氮唑蓝，每孔20μl,继续培养4h。吸净各孔培养液，加入二甲基亚砜150μl/孔振荡溶解10min。将空白组调零,采用酶联免疫检测仪测各孔A490nm。取6孔A490nm的均数按如下公式计算细胞抑制率(IR)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。同法重复做3个培养板,筛选出抑制作用最强的浓度范围。③检测人绒癌JAR细胞株：JAR细胞以1×105个/ml,接种于50ml培养瓶内(每瓶4ml),养24h后更换培养液。实验组含5-Fu 100μg/L,对照组含乙醇0.05%(V/V)。继续培养72h,每组各分别取5瓶,用0.25%胰酶消化、吹打,制成涂片,采用ABC免疫组化染色,封片后在显微镜下观察结果,细胞核着色的是Ki67阳性细胞,细胞核呈棕黄色,或棕色网状,或细胞核内出现棕色小颗粒。计数高倍镜下每张涂片上500个细胞内 Ki-67抗原阳性细胞数,以阳性细胞百分率为标准判断阳性结果。

3 统计学方法 所有统计学分析在SPSS 20.0上完成,采取方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 5-Fu对JAR细胞生长的抑制作用 见附表。MTT法检测结果显示25～100μg/L的5-Fu能明显抑制JAR细胞生长,在此浓度范围内呈剂量依赖性。72h内较高浓度的5-Fu显示较强的抑制作用。实验组3种浓度的5-Fu作用于JAR细胞后,最初2d细胞变化不明显,之后细胞增殖逐渐变慢,内有颗粒堆积,胞质粗糙,其中部分细胞附壁能力减弱，随之脱落死亡,碎裂成块。以100μg/L浓度的5-Fu作用最明显。而对照组细胞透明,附壁能力好。

附表 不同浓度的5-Fu作用72h对JAR细胞的抑制率±s)

注：与对照组比较，*P<0.01

2 5-Fu作用人绒癌细胞株JAR细胞后Ki-67抗原的表达 见图1、图2。实验组100μg/L的5-Fu与JAR细胞作用72h。Ki-67抗原表达阳性率为16.9%±0.2%，而对照组为82.1%±0.2%，实验组细胞Ki-67抗原阳性率较对照组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

1 5-Fu对JAR细胞生长的抑制作用 噻唑篮比色实验(MTT),是一种检测细胞生长和存活的常用方法[5]。MTT比色法测定结果发现实验组用药浓度(25、50、100μg/L)对JAR细胞生长均有抑制作用,并且随药物浓度的增加,抑制作用逐渐加强,表现出剂量依赖,显微镜观察结果也证实了该变化。提示5-Fu

图1 5-Fu 100μg/L 与JAR细胞作用72h,Ki-67抗原表达阴性(ABC染色×400)

图2 对照组JAR细胞 Ki-67 抗原表达阳性(ABC染色×400)

对绒癌生长有明显的抑制作用,这就是之所以临床应用5-Fu治疗绒癌的原因。但只能说明此浓度范围的作用,超出此浓度范围的5-Fu对绒癌细胞的作用仍不能下结论,是否会产生耐药等问题均为以后研究的课题；另外本研究作用时间只是72h,5-Fu对JAR细胞生长抑制是否具有时间依赖性有待以后进一步研究。

2 5-Fu对JAR细胞增殖的影响 Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少,但其确切机制尚不清楚。本研究采用ABC免疫组化法结果显示,100μg/L的5-Fu作用于JAR细胞72h,Ki-67表达阳性率较对照组明显下降,说明细胞增殖受到明显抑制,细胞可能被阻滞于G0期及G1早期而不被染色。

综上所述,体外5-Fu对JAR细胞的生长具有抑制作用,并在一定时间内呈剂量依赖性；5-Fu抑制了JAR细胞的增殖,细胞可能被阻滞于G0及G1期。

[1] 陈 静,司明远.宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌中细胞周期素D1、Ki67的表达[J].中国医药指南,2012,10(21)： 417-418.

[2] 谢伟晗,韩柏贞.Ki67在宫颈上皮内瘤变和鳞癌组织中表达及意义[J].中国优生与遗传杂志,2013,21(7)：33-34.

[3] 徐本群,周 琼.CD146与Ki67在葡萄胎组织中的表达及临床意义[J].中国医药科学,2012,2 (17)：29-31.

[4] 庞志澜,马丽辉.子宫内膜癌中E2F-1、Survivin和Ki-67的表达及相关性[J].现代肿瘤医学,2013,29(7)：170-174.

[5] 杨 越,张 蕾.EGFR及Ki67在上皮性卵巢癌中的表达及意义[J].中国医疗前沿,2013,16(14)：10-11.

(收稿：2015-01-29)

Effects of 5-Fluorouracil on choriocarcinoma cell line JAR

Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People's Armed Police Force(Xi’an 710054)

Pang Miaomiao Hui Jianrong An Ruifang

Objective：To investigate the effects of 5-FU on cell of human choriocarcinoma cell line JAR.Methods：The inhibitory effects of three different concentration of chemotherapeutical drug 5-Fu(5-Fluorouracil) (20,50,100μg/L) on JAR strain were assessed with methylthiazolyl tetrazolium MTT colorimetric assay.The expression of nuclear proliferative antigen Ki67 in JAR cells were detected with avidin-biotin complex method, immuno-histochemical method.Results：① 5-Fu inhibited the JAR cell growth in a dose-dependent manner . This effect was obvious at 25～100μg/L in 72h.② When the JAR cells were exposed to 100μg/L 5-Fu for 72h, the expression of Ki67 antigen was declined significantly,the inhibition rate was 73.19%. Conclusion：① 5-Fu inhibited the JAR cell growth in a dose-dependent manner at 72h.② 5-Fu inhibited the Proliferation of JAR cell，which may be inhibited at the Period of G0and G1.

Fluorouracil Choriocarcinoma Proliferating cell nuclear antigen Growth inhibitors

*陕西省教育厅课题(14JK1211)

氟尿嘧啶 绒毛膜癌 增殖细胞核抗原 生长抑制物

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.004

△陕西中医学院附属医院

▲通讯作者：西安交通大学第一附属医院