黄芪甲苷对胃癌细胞SGC7901侵袭能力的影响及其机制探讨

武警陕西省总队医院(西安710054) 曹 艳 何利红 孙 赟 于 泳

▲通讯作者

黄芪甲苷对胃癌细胞SGC7901侵袭能力的影响及其机制探讨

武警陕西省总队医院(西安710054) 曹 艳 何利红▲孙 赟 于 泳

目的：研究黄芪甲苷对胃癌细胞SGC7901侵袭能力的影响并探讨其可能的机制。方法：用终浓度为100μg /ml黄芪甲苷处理实验组细胞48h，之后采用流式细胞仪检测对照组和实验组细胞凋亡情况,Transwell细胞侵袭实验检测黄芪甲苷对细胞侵袭能力的影响,并采用PCR和Western-blot方法检测黄芪甲苷对细胞MMP-2和MMP-9表达的影响,最后采用Western-blot方法检测黄芪甲苷处理对细胞ERK通路的活化情况的影响。结果：100μg/ml黄芪甲苷处理胃癌细胞SGC7901 48h后,细胞凋亡比例未发生明显变化,细胞侵袭能力显著降低,MMP-2和MMP-9分子的mRNA和蛋白水平均下降,此外,细胞内的磷酸化ERK蛋白水平在黄芪甲苷处理后表达减少。结论：在体外黄芪甲苷能够通过减少细胞MMP-2和MMP-9的表达而发挥抑制胃癌细胞侵袭的能力，而且其抑侵袭作用一定程度上是通过抑制细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路实现的。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,由于胃癌的高侵袭转移特性,传统的治疗方法如外科手术、化疗和放疗等对其治疗效果有限。黄芪是常用的一种扶正益气类中药，含有许多药理成分,具有比较广泛的药理作用[1]。黄芪甲苷(A-IV)是黄芪的主要活性成分之一,研究发现其在体内体外均具有抗肿瘤作用[2]。最近的研究也表明,黄芪甲苷能够抑制包括胃癌在内的多种肿瘤细胞的侵袭能力,但其机制仍不清楚[3-4]。本实验旨在探讨黄芪甲苷对胃癌细胞株SGC7901侵袭能力的影响,并进一步研究其机制,为黄芪甲苷在临床抗肿瘤中的应用提供新的依据。

材料与方法

1 材 料 ①细胞培养与分组：胃癌细胞株SGC7901置于含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液中,37℃,5%CO2,饱和湿度的培养箱中进行连续培养。当细胞密度达到90%时,用0.25%胰蛋白酶进行消化并传代。整个实验分为对照组和实验组,对照组加入不含黄芪甲苷的DMSO溶剂,实验组加入终浓度为100μg/ml的黄芪甲苷培养液。②主要试剂：黄芪甲苷(纯度>98%)购自成都曼斯特生物科技有限公司,并根据说明书对药物进行合适的溶解并保存，使用时稀释至相应浓度；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Annexin-V和PI购自美国Sigma公司；Matrigel基质胶包被的Transwell小室购自美国BD公司；抗MMP-2、MMP-9、ERK、p-ERK、β-actin一抗购自美国Cell Signaling公司；二抗购自北京中杉金桥公司；MMP-2、MMP-9和β-actin引物由上海生工生物公司设计并合成；逆转录试剂盒和荧光实时定量PCR试剂盒购自Takara公司。

2 方 法 ①流式细胞仪检测细胞凋亡：对照组和实验组SGC7901细胞经处理48h后,常规胰酶消化两组细胞,离心,PBS洗3次,再用200μl PBS重悬于EP管中,加入5μl Annexin V-FITC避光孵育10min,之后再加入 10μl PI避光孵育10min,冰上运输,使用流式细胞仪检测细胞凋亡比例,激发光分别为488nm和530nm。②Transwell细胞侵袭实验：实验前,先更换无血清培养基培养SGC7901细胞过夜,次日以胰蛋白酶消化细胞,重悬后计数,调整细胞浓度为1×106个/ml；将Matrigel包被的Transwell小室放置在24孔细胞培养板内,向Transwell小室中加入两组SGC7901细胞悬液100μl(1×105个/孔),将细胞在37℃培养箱内培养24h,培养结束后取出小室,PBS洗2遍,用棉签小心擦拭小室内细胞,将小室置于95%乙醇中固定5min,用PBS配置0.5%结晶紫溶液,在摇床上室温下摇晃染色30min，染色完毕后PBS洗2次,静置干燥后倒置显微镜下观察,100倍光镜下随机选取多个视野对视野下的的细胞进行计数。③实时定量PCR：细胞处理完成后,Trizol裂解未干预组和干预组细胞并提取总RNA,后按照说明书逆转录合成cDNA。所有基因引物均由上海生工生物公司设计并且合成。β-actin上游引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,下游引物：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’；MMP-2上游引物：5’-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3’,下游引物：5’- TTCAGGTAATAGGCACCCTFGAAGA-3’；MMP-9上游引物：5’-ACGCACGACGTCTFCCAGTA-3’，下游引物：5’-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3’；PCR反应体系为25μl，扩增条件：95℃预变性3min，95℃ 变性5s，58℃退火延伸 30s，扩增进行40个循环，之后建立溶解曲线。每个反应孔设3个复孔,反应在Bio-Rad IQ5荧光实时定量PCR仪上进行，并采用仪器自带分析软件,运用2-ΔΔCT法分析基因相对表达量,以β-actin作为内参照。④Western-blot：SGC7901细胞经黄芪甲苷100μg/ml干预处理48h后,分别提取对照组和实验组细胞总蛋白,使用BCA法检测所提取蛋白的浓度,每孔蛋白上样量约30μg,经8%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后,转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶或3%牛血清白蛋白室温封闭1h,将相应的一抗根据说明书按照推荐比例稀释后,4℃摇晃孵育PVDF膜过夜,次日用辣根过氧化物酶标记的二抗稀释后室温下孵育PVDF膜1h,最后采用化学发光试剂盒显影，凝胶成像系统扫描蛋白条带,并用Gel Image System 软件对图像进行分析,结果以目标蛋白分别与β-肌动蛋白的比值表示。

结 果

1 黄芪甲苷对SGC7901细胞凋亡的影响 当100μg/ml黄芪甲苷处理SGC7901胃癌细胞48h后,流式细胞仪检测黄芪甲苷对SGC7901细胞凋亡的影响，通过3次独立重复实验,发现对照组与实验组的细胞凋亡比例分别为4.1±0.8%、3.7±0.9%，两组比较无统计学差异(P>0.05)。说明黄芪甲苷对SGC7901细胞凋亡无明显影响,见图1。

图1 100μg/ml黄芪甲苷处理48h对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响

2 黄芪甲苷抑制SGC7901细胞侵袭能力 在黄芪甲苷对细胞凋亡不产生影响的前提下，通过Transwell实验检测其对细胞侵袭的影响。结果表明：与对照组相比，实验组穿过Transwell小室的细胞数明显减少(图2A)；通过对3次独立实验中所选取的随机视野进行细胞计数及统计分析，发现两组细胞的侵袭能力存在差异(P<0.05，图2B)。

3 黄芪甲苷对SGC7901细胞MMP-2和MMP-9表达的影响 由于基质金属蛋白酶(MMPs)家族是介导肿瘤细胞侵袭迁移的重要因素。而这其中，MMP-2和MMP-9是降解肿瘤基质膜的最重要成分。因此，我们通过PCR和Western-blot检测了黄芪甲苷对胃癌SGC7901细胞中MMP-2和MMP-9表达的影响,结果显示：无论是mRNA水平(图3A)还是蛋白水平(图3B)，MMP-2和MMP-9的表达均受到抑制(P<0.05)。提示黄芪甲苷对胃癌细胞侵袭能力的抑制部分是通过抑制了细胞中MMP-2和MMP-9的表达而引起的。

4 黄芪甲苷对SGC7901细胞ERK通路的影响 研究表明MMP-2和MMP-9的表达受多种信号通路的调控,而ERK通路是调控MMP-2和MMP-9的关键信号通路之一[5]。我们假设黄芪甲苷通过该通路引起了MMP-2和MMP-9的表达变化,为验证该通路是否参与了黄芪甲苷引起的胃癌细胞侵袭能力降低,采用Western-blot的方法检测了黄芪甲苷对细胞ERK通路的影响。如图4所示，在对照组和实验组细胞中，总ERK蛋白并无明显变化，而其磷酸化状态(p-ERK)在实验组中明显降低,说明黄芪甲苷抑制了ERK蛋白的活化。

图2 100μg/ml黄芪甲苷处理48h对胃癌细胞SGC7901侵袭能力的影响(×100)

图3 100μg/ml黄芪甲苷处理48h对SGC7901胃癌细胞MMP-2和MMP-9mRNA蛋白表达的影响

图4 100μg/ml黄芪甲苷处理48h对SGC7901胃癌细胞ERK通路的影响

讨 论

自从黄芪甲苷的抗肿瘤效应被发现以来，黄芪已被当作多种肿瘤的有效治疗手段之一。近几年来，对黄芪甲苷抗肿瘤机制的深入研究表明,黄芪甲苷能够通过调节免疫功能、抑制细胞增殖生长、诱导肿瘤细胞凋亡以及抗肿瘤血管生成等方面从而发挥抗肿瘤作用[5]。同时,也有研究表明黄芪能够抑制高转移性肝癌细胞MHCC97-H、和胃癌细胞MKN-74和MKN-45的侵袭转移能力[6]。提示了黄芪在抑制肿瘤侵袭转移方面也具有一定作用。细胞侵袭转移是一个多步骤过程，有多种分子参与其中。已有初步发现黄芪的抗侵袭作用很有可能是通过抑制细胞COX-2、VEGF、MMP-2等的表达而引起的[7]。但是黄芪通过何种机制调控着这些侵袭促进分子,仍不清楚。由于MMPs家族是降解肿瘤基质膜，促进肿瘤细胞发生侵袭转移的必要前提，因此我们检测了黄芪甲苷处理胃癌细胞后MMP-2和MMP-9的表达变化，我们发现在细胞接受黄芪甲苷处理48h之后，两者的表达无论在mRNA还是蛋白水平都发生了下调，这与其他学者在肝癌中的报道一致[8]。同时细胞凋亡结果显示黄芪甲苷处理后，细胞未发生明显凋亡比例的增加,排除了其对细胞侵袭的抑制作用是通过促进细胞凋亡而引起的。进一步，我们通过检测有可能参与调控MMP-2和MMP-9的上游信号通路的激活情况,我们发现ERK通路在黄芪甲苷处理后，其激活情况被抑制。ERK通路是已知的调控细胞MMPs分泌的重要上游开关[5-6]。因此我们的结果说明了黄芪甲苷对胃癌细胞侵袭能力的抑制作用很有可能是通过ERK通路而实现的。同时作为调控肿瘤细胞生长和增殖的分子开关，ERK在多种肿瘤组织中均存在过度激活的状态,而体外试验也发现,黄芪甲苷对多种肿瘤细胞增殖具有明显抑制作用[3]。因此,我们推测黄芪甲苷对肿瘤细胞的抑增殖作用也有可能通过ERK通路而实现，但是仍需要进一步实验验证。由此可见，黄芪甲苷有可能通过多种调控机制发挥着抗肿瘤作用，需要我们对其进行进一步地发掘和验证，才能为其在临床上的应用提供更多的理论依据。

综上所述，本实验在体外通过研究黄芪甲苷对胃癌细胞系SGC7901侵袭能力的影响，证明了黄芪甲苷的抗肿瘤侵袭作用。并验证了其对细胞侵袭能力的影响是部分通过抑制细胞MMP-2和MMP-9的分泌而实现的，除此之外，本研究首次报道了黄芪甲苷能够通过抑制ERK通路而实现肿瘤细胞侵袭能力的降低，为黄芪甲苷在临床中的广泛应用提供了理论依据和实验基础。

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[2] 崔春利,王 梅,郭东艳,等.HPLC-ELSD测定芪黄颗粒中的黄芪甲苷[J].陕西中医,2013,34(2)：236-237.

[3] Cho WC,Leung KN.In vitro and in vivo anti-tumor effects of Astragalus membranaceus[J].Cancer Lett, 2007,252：43-54.

[4] 马鹏飞,阮 柏,王德盛,等.黄芪甲苷对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制研究[J].现代肿瘤医学, 2014,22：1012-1015.

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(收稿：2014-10-16)

The anti-invasion effects of astragaloside IV on gastric cancer cell line SGC7901 and its related mechanism

Shaanxi Provincial Corps Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force(Xi’an 710054)

Cao Yan He Lihong Sun Yun et al

Objective：To investigate the effects of astragaloside IV on the invasive capacity of gastric cancer cell line SGC7901 and to explore the potential mechanisms involved. Methods：The SGC7901 cell was treated with or without 100μg/ml astragaloside IV for 48h.After astragaloside IV administration,the apoptotic cells between the control group and the experimental group were detected by flow cytometry,the invasive capacity was measured by transwell invasion assay,the expression of MMP-2 and MMP-9 was leveled by PCR and Western-blot. Finally, the status of the ERK pathway was analyzed by Western-blot to further elucidate the impact of astragaloside IV on SGC7901 cells.Results：After being treated with or without 100μg/ml astragaloside IV for 48h, the SGC7901 cell possessed non-significant proportion of apoptosis.The invasive capacity,the MMP-2 and the MMP-9 expression were obviously impaired after astragaloside IV treatment. Besides,Western-blot assay showed that the phosphorylation of ERK was decreased in the experimental group. Conclusion：Astragaloside IV can inhibit the invasive capacity of gastric cancer cells through diminishing the MMP-2 and the MMP-9 expression. And the anti-invasion effects of astragaloside IV is possibly mediated by inactivating the ERK pathway.

Astragaloside IV Gastric neoplasms Neoplasm metastasis Matrix metalloproteinases @ERK

黄芪甲苷 胃肿瘤 肿瘤转移 基质金属蛋白酶 @细胞外信号调节激酶

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.006