SAS正交设计筛选通关藤组培诱导培养基的研究

韩 俊，杨生超，王自林，黄 鹤

(云南农业大学，云南昆明 6502010)



SAS正交设计筛选通关藤组培诱导培养基的研究

韩 俊，杨生超，王自林，黄 鹤

(云南农业大学，云南昆明 6502010)

[目的]筛选最佳的通关藤诱导培养基。[方法]以红河通关藤当年新生枝的顶芽与茎段作为外植体，在光照时间12 h/d、光照强度2 000 lx、温度(25±2)℃、pH为5.8培养条件下,采用SAS正交设计比较不同基本培养基, 细胞分裂素、生长素和不同部位的外植体对外植体芽的诱导率和新芽生长状况的影响。[结果]诱导培养基最佳的配方为MS+琼脂 7g/L+蔗糖25 g/L +6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。[结论]该研究为通关藤的快速繁殖提供理论依据和技术支持。

通关藤；SAS正交设计；组织培养；培养基筛选

通关藤(Marsdeniatenocissima(Roxb) Wight et Arm)为萝藦科牛奶菜属藤本植物，又名乌骨藤，始载于《滇南本草》，广泛分布于亚洲的热带和亚热带地区。其全株均具有清热解毒、消炎止痛和止咳平喘之功效[1]。通关藤所含的乌骨消癌素(C21- 甾体甙和乌骨总碱)对癌细胞分裂的根源 - 微管排列有很强的破坏作用，可阻断癌细胞的有丝分裂，从而有效切断癌细胞扩散、转移，癌症因此萎缩直至完全消失[2]。可用于晚期肺癌[3]、急性白血病[4]、食管癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]等各种晚期恶性肿瘤的治疗，以通关藤为主要原料制备而成的中药消癌平制剂[8]，疗效良好。

通关藤主要来源自然繁殖和有限的野生资源。由于其自身花多果少的生物特性，植物自然繁殖力低。加之，高强度的砍伐采收，致使当前通关藤野生资源量急剧减少，人工繁育或栽培势在必行。优质种苗的快速获取是通关藤栽培最为关键的基础环节。而通关藤种子繁殖得到的实生苗，品种极容易退化，且生长周期长，结实率低；其次扦插繁殖虽然成活率高，但后期感病严重，作为中药材这种特殊的商品，很难满足药业市场的需求。因此，探索一种适宜规模化生产的、繁殖快的、抗性好的通关藤无菌优质组培苗的方法，对保证通关藤原料药材的持续供应具有重要的意义。目前，通关藤的研究主要集中于植物有效成分及其药理作用方面，尚无通关藤组织培养快速繁殖技术方面的研究报道。因此该研究采用SAS软件设计了不同基本培养基、不同外植体部位、NAA与6-BA多浓度水平的多因素正交试验,研究不同处理对通关藤茎尖顶芽与茎段侧芽的诱导分化及芽生长状况的影响,从中筛选出最适宜的诱导培养基,为通关藤的快速繁殖提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 由云南红河圣和植物药业有限公司提供的通关藤，经栽培驯化后，选择各项生长指标较优的单株作为研究试验材料。

1.2 无菌材料的建立 于晴天午后，剪取优株茎尖作为外植体，按常规灭菌程序灭菌，用流水冲洗2～3 h,再用5%洗衣粉水浸泡3～5 min后用流水冲洗20～25 min，再经无菌水清洗3遍后在无菌条件下进行以下操作：用75%乙醇溶液浸泡0.5 min，然后用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min,再用无菌水洗涤5～6 次后，沥干消毒好的外植体，去除茎上幼叶, 将茎段剪成约1 cm长，分别接种在9个处理中,采用4因素3水平的正交试验设计L9(34)安排试验(表1),每个处理设5次重复,每瓶接种3个外植体。以探索不同培养基、接种不同部位的外植体和不同浓度激素对通关藤(顶芽与侧芽)诱导率和新芽生长状况(平均茎粗与平均茎高)的影响。50 d后观察并记录试验数据，如H(平均芽粗)、I(平均芽高)、J(诱导率),并采用SAS软件对试验数据进行处理分析。

1.3 培养条件 培养基中加入琼脂 7.1 g/L、蔗糖25 g/L，pH 5.8。培养光照时间12 h/d,光照强度2 000 lx,温度控制在(25±2)℃。

2 结果与分析

2.1 红河通关藤组培苗生长习性 在组织培养中，红河通关藤的茎尖与茎段的生长及分化需要较长的时间,一般要在12～15 d才能用肉眼观察出变化。茎尖的茎节部早期长出黄绿色的小芽, 随着培养时间的延长逐渐转为绿色,芽逐渐变粗长高,其上有新的小叶片与小芽长出，随后叶片向上舒张开，逐渐长大。在整个培养过程中偶然可见到部分茎段的茎节处有新的淡绿色膨大如圆团状的愈伤组织产生,但一直没有见到愈伤组织分化出来的新芽。因此，笔者获取通关藤小植株是通过对其茎尖与茎段的顶芽和侧芽进行诱导芽丛和小植株而得。

2.2 SAS正交设计筛选通关藤组培诱导培养基

2.2.1 方差分析。方差分析结果表明，培养基(A)、6-BA(B)、NAA(C)、外植体(D)对诱导生长出的芽粗、芽高和芽诱导率均存在极显著的相关性，A、B、C对芽粗、芽高和芽诱导率的生长影响均比较大，D的影响最小；A、B、C、D 4个因子的主效应差异均达到极显著水平，即每个因子的各个水平间在平均芽粗、平均芽高、诱导率上存在极显著差异，且4个因子对通关藤芽生长状况的平均芽粗、平均芽高和芽诱导率影响大小依次是A>B>C>D。

2.2.2 主效应多重比较，选出各因素的最优水平组合。因为该试验设计了4个因素，每个因素分3个水平，经方差分析结果显示，每个因子的各个水平间在平均芽粗、平均芽高、诱导率上均存在极显著差异，因此进一步对每个因子的多重比较具有了统计学意义，可从各因素水平间的多重比较中选出各因素的最优水平组合。从主效应的多重比较(表1)可以看出，在A的3个水平中，A2水平对平均芽粗、平均芽高和诱导率的影响极显著高于A1和A3，即A2是最好的水平；在B的3个水平中，B2水平对诱导率的影响极显著高于B3和B1，即B2是最好的水平；在C的3个水平中，C3水平对诱导率的影响极显著高于C2和C1，即C3是最好的水平；在D的3个水平中，D2、D3水平对诱导率的影响极显著高于D1，即D2和D3之间差异不显著。导致这样的结果可能有2个方面的原因：一是D的水平间的极差过小，尤其是D2和D3之间的极差过小；二是D的水平提高到了D2已经到了对诱导率影响的极限，进一步提高D因子的水平对诱导率的影响已经意义不明显。

2.2.3 处理间效应的多重比较。方差分析结果显示处理间效应差异极显著，各个处理间对诱导率影响的多重比较具有统计学意义，可从各处理间找出最优组合。从处理间效应的多重比较(表1)可以看出，第5个(A2B2C3D1)处理对诱导率和芽生长的影响极显著高于其他处理，其次是第4个处理，再次是第6个处理。综合4个因子主效应的多重比较及处理间效应的多重比较结果，A2B2C3D1是相对比较理想的组合方式，不仅处理间效应高，且A、B、C的主效应也高，但在这一组合方式中D的主效应不高。

表1 正交设计试验方案及试验结果 (n=9)

注：同列数据后不同大写字母表示处理间差异显著(P<0.01)。

3 结论与讨论

该试验采用红河通关藤当年新生枝作为外植体，研究在不同培养基(B5、MS和1/2MS)、不同激素(6-BA、NAA)和不同茎段部位(茎尖、茎中和茎基)对外植体芽的诱导率和新芽生长状况(芽粗和芽高)的影响。结果表明，在光照时间为12 h/d、光照强度为2 000 lx、温度为(25±2)℃、pH为5.8培养条件下，MS培养基最适宜通关藤的顶芽与侧芽的诱导和生长，1/2MS培养基对通关藤的诱导培养次之，B5培养基对通关藤顶芽和侧芽的诱导率以及芽生长状况影响最小。在0.1～0.5 mg/L NAA时对红河通关藤顶芽与侧芽的诱导和生长均有不同程度的促进，NAA对芽的诱导率和新芽生长状况的影响作用是随着质量浓度的增加而增加的，可见NAA在低质量浓度时对红河通关藤所表现出来的激素效应就很明显。6-BA在1.5～2.5 mg/L时其促进芽的诱导分化和生长的效果呈极显著，说明红河通关藤对6-BA具有较高的质量浓度耐受性。6-BA在1.5～2.0 mg/L时其促进顶芽与侧芽诱导分化和芽生长的作用是随着质量浓度的增加而增加，在2.0～2.5 mg/L时其促进顶芽与侧芽诱导分化和芽生长的作用是随着质量浓度的增加而减小。由此可知，在采用MS培养基、茎中作为外植体，NAA 0.5 mg/L与6-BA 2.0 mg/L组合时对红河通关藤顶芽与侧芽的诱导分化和芽生长效果最显著，即诱导培养基最佳的配方为MS+琼脂 7 g/L+蔗糖25 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

从该试验看出，正交试验是筛选最佳试验方案的一个十分有效的工具，该试验采用L9(34)正交设计试验的方法，用较少的9个试验处理组合来优化筛选出诱导培养基最佳配方，效率较高。只是在今后研究红河通关藤的组织诱导培养及后续的增殖培养、壮苗培养和生根培养时，可以将植物激素的浓度水平范围适当放宽，从而获得最为理想的培养配方。

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[2] 李东,欧阳建,李翠萍,等.通关藤对U937细胞凋亡相关基因表达谱的影响[J].中国生化药物杂志,2008,29(4):240-243.

[3] 刘荣成.消癌平注射液治疗晚期肺癌疗效观察[J].宜春学院学报,2003,25(5):86.

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[8] 石涛.消癌平注射液临床应用1009例分析[J].江苏医药,2012,38(9):1109-1110.

Study on Screening by SAS Orthogonal Design in Induction Medium of Tissue Culture forMarsdeniatenacissima

HAN Jun, YANG Sheng-chao, WANG Zi-lin et al

(Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

[Objective] The study aimed to screen the optimum induction medium of tissue culture forMarsdeniatenacissima.[Method] The tissue culture of the stem segment and terminal bud of new growing branch of HongheMarsdeniatenacissimawere taken as the explant for induction medium compared by SAS orthogonal design of the effects, such as different basic culture medium cytokinin, growth hormone and the explant of different parts, on the growth ofMarsdeniatenacissimaunder the culture conditions of light time of 12 h/d, light intensity of 2 000 lx and temperature of (25±2)℃ and pH of 5.8.[Result] The optimum for induction medium of tissue culture forMarsdeniatenacissimais MS+ agar 7 g/L+ sucrose 25 g/L+NA A0.2 mg/L+6-BA 2 mg/L.[Conclusion] The study can provide theoretical basis and technical support for rapid propagation ofMarsdeniatenacissima.

Marsdeniatenacissima; SAS orthogonal design; Tissue culture; Medium screening

云南农业大学与圣和集团云南圣和植物药业有限公司(全额支助)的横向课题(20130306)。

韩俊(1972-)，女，云南砚山人，讲师，硕士，从事中药的功用及药用植物的生理生化研究。

2015-04-15

S 567

A

0517-6611(2015)14-098-02