一株从片烟中分离的纤维素酶产生菌B.Pumilus培养条件优化研究

刘 晔，高 娃，陈善义，王金华，范坚强*

(1.湖北工业大学发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北武汉 430068；2.福建中烟工业有限责任公司，福建厦门 350003)



一株从片烟中分离的纤维素酶产生菌B.Pumilus培养条件优化研究

刘 晔1，高 娃1，陈善义2，王金华1，范坚强2*

(1.湖北工业大学发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北武汉 430068；2.福建中烟工业有限责任公司，福建厦门 350003)

[目的] 优化短小芽孢杆菌(B.Pumilus)菌株TX3产纤维素酶条件，为其降解片烟中所含纤维素提供理论依据。[方法] 应用单因子试验考察碳源种类、烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度和pH对菌株TX3发酵产纤维素酶的影响，在此基础上选取烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH作为显著因子，采用响应面分析法对此3种显著因子进行优化和分析。[结果] 菌株TX3最适产酶条件为发酵初始pH 6.93，烟梗粉末添加量1.24%，硫酸铵浓度0.35%，以此条件进行揺瓶发酵72 h，其纤维素酶活力达到9.91 U/ml，比优化前高了31.4%。[结论] 烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH对菌株TX3产纤维素酶单个及交互影响均显著。

烟梗粉末；响应面分析；纤维素酶；培养条件

我国是世界上烟草栽培面积最大的国家，每年烟叶产量为4.5×106～5.0×106t[1]。烤烟生产在我国烟草发展中占有重要地位，由于栽培和烤制等原因，目前国内烤烟烤后纤维素残留量较高[2]。烟草中大分子物质如纤维素、木质素等在缺氧条件下不完全燃烧会产生烟草焦油，是众多烃类、烃氧化物、烃硫化物、烃氮化物等复杂的混合物，还包括亚硝胺和苯酚类等多种致癌物质[3]。这使得烟叶在卷烟生产中的应用受到了很大的限制。烟叶化学成分是影响烟叶内在质量的物质基础，烟叶中总糖、还原糖等化学成分因为对烟叶质量有重要影响而成为烟草行业日常的检测指标。经研究，卷烟香气质与水溶性糖正相关，余味与还原糖正相关[4]。

为降低片烟中大分子纤维素的含量，可在烤后烟叶上喷洒纤维素水解酶将残留纤维素降解为可溶性还原糖，不仅可以降低吸烟对人体的危害，且能提高卷烟口感[5-8]。利用商品酶或微生物降解纤维素原料是当前研究较多的一种纤维素降解方法，由于商品酶产酶菌株不明，价格较高，在实际应用中难以控制成本[9]。目前已有研究利用微生物降解烟秆[10]中纤维素，但前者菌株来源于药渣堆肥，不适宜应用于卷烟生产。

在发酵过程中纤维素酶可受纤维素性碳源诱导产生，所以碳源的种类以及与其他原料的配比对产酶影响显著[11]。湖北工业大学发酵工程省部共建教育部重点实验室从福建中烟公司纯化后的片烟中筛选出一株可降解纤维素酶菌株TX3，经鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus)。由于菌株来源于片烟表面，且烟秆中纤维素含量丰富[12]，故笔者在该试验中主要研究烟秆粉末对菌株TX3产纤维素酶的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。短小芽孢杆菌TX3，此菌株分离于福建中烟纯化后的片烟中，保藏于-80 ℃甘油管中。

1.1.2 纤维素原料。将烟梗、麸皮烘干后粉碎，过40目筛，于自封袋中保存待用。

1.1.3 培养基。斜面培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，自然pH。种子培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH。发酵培养基：CMC-Na 5 g/L，麸皮20 g/L，硫酸铵 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，酵母粉0.5 g/L，CaCl20.4 g/L，KH2PO41 g/L，蛋白胨2 g/L，pH 7.2，以此为基础培养基使用。

1.2 培养方法

1.2.1 菌种活化。 将菌株自甘油管中划线至斜面，37 ℃培养24 ～ 36 h，活化2 ～ 3代。保存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.2 种子揺瓶培养。 在250 ml锥形瓶中加入100 ml种子培养基，从斜面中挑取一个单菌落接种到种子培养基中，37 ℃、150 r/min摇瓶培养6～7 h，使OD600在1.2～1.8。

1.2.3 发酵产酶培养。在250 ml锥形瓶中加入100 ml发酵培养基，按体积分数2%接种量接种，30 ℃、200 r/min揺瓶培养。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备。 采用揺瓶液体发酵培养菌株TX3，培养72 h后，将发酵培养液6 000 r/min离心5 min，收集上清液即为粗酶液。

1.3.2 葡萄糖标准曲线绘制。 取不同量葡萄糖标准溶液(1 mg/L)，分别置于25 ml比色管中，并补去离子水至1.5 ml，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液，向各管中加入3 ml DNS溶液，振荡摇匀后沸水浴5 min，冷却后加4.5 ml去离子水，摇匀。在540 nm波长下测定各管溶液的吸光光度值，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的吸光度值(OD值)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

1.3.3 纤维素酶活力测定。 将粗酶液稀释至适宜浓度，在25 ml具塞刻度试管中加入0.5 ml粗酶液和1.0 ml去离子水，在50 ℃水浴锅中预热5 ～ 10 min，再加入50 mg滤纸条，保持50 ℃反应1 h。取出后立即加入3 ml DNS试剂终止酶反应，在100 ℃沸水浴中加热5 min后迅速冷却，再加入4.5 ml去离子水，振荡。在540 nm波长下测定吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，转换成酶活力单位(U/ml)。

酶活力定义：pH 7.0，50 ℃条件下，每1 h分解滤纸产生1 μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.3.4 产酶发酵条件优化。

1.3.4.1 单因子试验。采用液体揺瓶发酵，分别考察碳源种类、烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度和pH对菌株TX3发酵产纤维素酶活力的影响。

1.3.4.2 响应面分析试验。采用液体揺瓶发酵，在单因子试验的基础上，进行响应面分析试验，以纤维素酶活力定义为因变量Y，烟梗粉末添加量(A)、硫酸铵浓度(B)和pH(C)为自变量。

1.3.5 发酵罐产酶培养。根据响应面分析结果，以最适条件进行发酵罐培养。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对产酶的影响 在发酵培养基中分别添加2.0%葡萄糖、1.0%葡萄糖和1.0%麸皮、2.0%麸皮、2.0%麸皮和0.5%烟秆粉末作为碳源，30 ℃，200 r/min，摇瓶培养72 h后，测定酶活力。由图1可见，以2.0%麸皮和0.5%烟梗粉末为碳源时酶活力高于其他几种单一碳源，为7.89 U/ml；以2.0%麸皮为碳源时酶活力为5.94 U/ml；以2.0%葡萄糖为碳源时，酶活力最低为1.33 U/ml；这是因为麸皮和烟梗粉末为纤维素原料，能诱导纤维素酶的产生，葡萄糖为非纤维素类原料，对纤维素酶的产生无诱导作用。

图1 不同碳源对发酵产酶的影响

2.2 烟梗粉末添加量对产酶活性的影响 在发酵培养基中添加2% 麸皮和0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 的烟梗粉末作为碳源，按体积分数2.0%的接种量接种，30 ℃，200 r/min，摇床培养72 h后，测定酶活力。由图2可见，在一定范围内，增大烟梗粉末的添加量，酶活力也随之增大，烟梗粉末添加量为1.5% 时酶活力最大为9.44 U/ml，当添加量为1.0%～2.0% 时酶活力变化不明显。其原因可能是：纤维素类物质含量不足，对纤维素酶诱导作用有限，产酶量少，酶活力偏低；随着烟梗粉末添加量增加，对酶诱导作用增大；当添加量为1.5% 时，纤维素酶活力不再随着烟梗粉末添加量的增加而增加。

图2 烟梗粉末添加量对产酶活性的影响

2.3 硫酸铵浓度对产酶活性的影响 在发酵培养基中添加2.0% 麸皮和1.5% 烟梗粉末作为碳源，以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% 硫酸铵为氮源，接种量为2.0% 体积比，30 ℃，200 r/min，摇瓶培养72 h后，测定酶活力。由图3可见，硫酸铵浓度在0.1% ～ 0.3% 时，纤维素酶活力随硫酸铵浓度提高而增大；当硫酸铵浓度为0.3% 时酶活力最大，为9.65 U/ml；此后随着硫酸铵浓度升高，酶活力下降。产生此现象的原因是，硫酸铵浓度过高或过低，则碳氮比偏低或偏高，均不能为菌体生长提供合适碳氮比。故硫酸铵最适浓度为0.3%。

图3 硫酸铵浓度对产酶活性的影响

2.4 发酵起始pH对产酶活性的影响 以2.0% 麸皮和1.5% 烟梗粉末作为碳源，氮源硫酸铵浓度为0.3%，发酵培养基起始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。按照体积分数2%的接种量接种，于30 ℃、200 r/min培养72 h后，测定酶活力。由图4可知，培养基起始pH对酶活力影响很大，在pH 5.0 ～ 7.0时，随着pH的升高，酶活力呈上升趋势，在pH为7.0时酶活力最高，为9.72 U/ml；当pH高于7.0 时，随着pH的升高，酶活力下降。说明发酵液起始pH偏酸(<5)或偏碱(>7)均不利于菌株产酶。pH对培养基中一些成分的解离度有影响，同时对酶的稳定性也有一定影响。试验表明，发酵培养基起始pH为中性时最适宜该菌株发酵产纤维素酶。

图4 发酵起始pH对产酶活性的影响

2.5 响应面法优化产酶培养基 综合单因子试验所得结果，选取烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度和pH 3个因素，对菌株TX3发酵产酶培养基进行响应面分析。用Design-Expert 8.0软件设计3因素3水平试验，因素水平设计见表1，根据设计进行试验，相应结果如表2所示。

表1 Box- behnken试验设计

利用Design Expert 8.0对数据进行多元二次回归拟合得到酶活力Y对自变量烟梗粉末添加量(A)、硫酸铵浓度(B)、pH(C)的二次多项回归方程为：Y=-54.305 89+4.305 21A+23.800 72B+16.523 55C+2.105 26AB-0.134 21AC-0.493 75BC-1.662 88A2-32.831 25B2-1.168 31C2。回归方程方差分析(ANOVA)显示，F模型=1 422.53，P模型<0.000 1；

表2 Box-behnken 试验结果

FA=192.73，PA< 0.000 1；FB=272.97，PB< 0.000 1；FC=49.70，PC=0.000 2；FAB=66.92，PAB< 0.000 1；FAC=27.20，PAC=0.001 2；FBC=16.31，PBC=0.004 9；FA2=991.59，PA2<0.000 1；FB2=759.30，PB2<0.000 1；FC2=9 615.11，PC2<0.000 1；F失拟=3.54，P失拟=0.126 9(调整系数R2= 0.990 2)。可以看出，F模型=1 422.53，P<0.000 1，模型显著；F失拟=3.54，失拟项P=0.126 9>0.05，失拟不显著；A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2项P<0.05，影响显著。Design Expert 8.0 软件中Box-Behnk法计算回归模型的调整确定系数(AdjR．squared)AdjR2=0.990 2，即该模型能解释99.02% 响应值的变化，说明该模型拟合程度良好、试验误差小，以此模型优化菌株TX3产纤维素酶培养基是可行的。

试验得出了3种影响因子在 Box-Behnk 试验设计下影响产酶的回归方程系数及其显著性检验[13]。结果表明，烟梗粉末添加量与硫酸铵浓度的一次项、3种显著因子的二次项以及烟梗粉末与硫酸铵的交互作用对产酶活力有显著影响(P<0.000 1)，pH一次项、烟梗粉末添加量与pH、硫酸铵浓度与pH的交互作用对产酶活力也影响显著(P<0.05)。各影响因素交互作用见图5～7。

图5 烟梗粉末与硝酸铵的交互作用

图6 烟梗粉末与pH的交互作用

图7 硫酸铵与pH的交互作用

对模型方程进行典型性分析，结果表明，模型具有稳定点，稳定点为其最大值。模型给出的最优组合为烟梗粉末添加量为1.24%，硫酸铵浓度为0.35%，pH 6.93，在此条件下预测最大酶活力为Ymax= 9.75 U/ml。为了证明模型预测的准确性，在最优条件下进行3次平行的重复验证试验，结果均值为9.91 U/ml。这说明模型方程可信度较高，试验值与预测值基本相符，能够很好地预测试验结果。

3 结论

从片烟表面分离得到的产纤维素酶菌株TX3，已测知产酶活力为7.54 U/ml，由单因子试验可知，烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH等对菌株产纤维素酶有不同程度的影响，较适发酵培养基为烟梗粉末1.5%，硫酸铵浓度0.3%，pH 7.0。

在单因子试验基础上，采用RSM 法进一步优化，研究结果表明，烟梗粉末添加量、硫酸铵浓度、pH等因素对菌株TX3 发酵产纤维素酶活力均影响显著，得出最佳发酵产酶培养基为烟梗粉末1.24%，硫酸铵浓度0.35%，pH 6.93，利用此发酵培养基发酵产酶活力达到9.91 U/ml，比优化前高了31.4%。由于菌株TX3来源于片烟表面，优化后的菌株产酶活力较高，应用于烤烟纤维素的降解，符合安全标准，为其在生产实践中的应用提供了理论依据。

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Optimization of Fermentation Conditions for Cellulase Production byB.pumilusIsolated from Tobacco Surface

LIU Ye1, GAO Wa1, CHEN Shan-yi2, FAN Jian-qiang2*et al

(1. Key Laboratory of Fermentation Technology Ministry of Education, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068; 2. China Tobacco Fujian Industrial Co.,LTD, Xiamen, Fujian 350003)

[Objective] The purpose was to optimize the conditions of cellulase production by TX3 and provide fundamental basis for degradation of cellulose in tobacco. [Method] Single factor design was applied to investigate the effect of carbon sources, tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and initial pH on cellulase production. Tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and pH were selected as significant factors. Response surface method was used to optimize the significant factors. [Result] The optimal fermentation conditions of cellulase production by TX3 were tobacco stem powder 1.24%, ammonium sulphate 0.35% and initial pH 6.93. Flask fermentation with the optimal conditions as medium content was carried out. The result showed that the cellulase activity was 9.91 U/ml which is 31.4% higher than primary experiment. [Conclusion] The effects of tobacco stem powder concentration, ammonium sulphate concentration and pH on cellulase production were significant.

Tobacco stem powder; Response surface method; Cellulase; Culture condition

刘晔(1988- )，女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：生物工程。*通讯作者，从事烟叶原料方面的研究。

2015-04-21

S 572

A

0517-6611(2015)17-306-04