HPLC法测定柴胡桂枝颗粒中桂皮醛和桂皮酸的含量

范广建 张坚

柴胡桂枝汤为小柴胡汤和桂枝汤的合方，主要用于太阳少阳合病引起的发热恶寒、肢体疼痛等症［1］。柴胡桂枝汤在现代临床应用也十分广泛，主要用于治疗 发 热［2-9］、循 环 系 统 病 症［10-13］、消 化 系 统 病症［14-20］、内分泌系统病症［21］、植物神经功能紊乱［22］及妇科疾病［23］等。由于传统汤剂煎煮麻烦、服用剂量大、不方便携带及口味难以下咽，而中药配方颗粒具有剂量准确、即冲即服和贮存携带方便等特点，克服了传统中药饮片调配称量不够准确、服用剂量不易掌握、易污染等缺点［24］。故而在柴胡桂枝汤的基础上经过工艺优化开发了柴胡桂枝颗粒，但现有柴胡桂枝颗粒的质量标准只对黄芩中的黄芩苷进行了含量测定，但对君药柴胡和桂枝的指标性成分的含量测定尚未见报道，作者采用HPLC法建立了同时测定君药桂枝中的桂皮酸和桂皮醛的含量的方法，由此为柴胡桂枝颗粒提供了一种简单、准确地质量控制手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪及工作站(美国Agilent公司);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);AS系列超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2 试药 柴胡桂枝颗粒(由本院研发中心提供，批号为 091401，091403，091404，091405)，桂皮酸、桂皮醛对照品(中国药品生物制品检定所提供)，乙腈、冰醋酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为蒸馏水，甲醇为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品贮备液的制备:取桂皮酸对照品12.65 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1毫升中含桂皮酸0.25 mg)。精密称取桂皮醛对照品10.60 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1毫升中含桂皮酸1.06 mg)。

2.1.2 供试品溶液的制备:取本品适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50.0 ml，密塞，称定质量，超声提取(功率400 W，频率25 kHz)30 min，放至室温后，再称定质量，以甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备:按照柴胡桂枝颗粒的处方及制备工艺，制备不含桂枝的阴性样品，按2.1.2项下制备阴性样品溶液。

2.2 色谱系统适应性试验 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:乙腈-1.0%醋酸水溶液(30∶70)，检测波长290 nm，流1.0 ml/min，进样量 10 μl，柱温:35℃。在此条件下，理论塔板数(N)按桂皮酸峰计算为5 000，按桂皮醛峰计算为3 900。桂皮酸和桂皮醛色谱峰与其他杂质峰分离度大于1.5。结果显示，在上述波长下样品色谱峰分离度很好，并且阴性供试品溶液对桂皮酸和桂皮醛的测定无干扰。

2.3 方法学考察

2.3.1 检测波长测定:以流动相为空白对照，在200～400 nm范围内对桂皮酸和桂皮醛对照品稀释液进行扫描。结果显示，桂皮酸和桂皮醛均在290 nm处有最大吸收峰，故以290 nm为检测波长。

2.3.2 线性关系考察:精密吸取桂皮酸对照品贮备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml分别置 50 ml量瓶中，再依次分别精密加入桂皮醛对照品贮备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml于相应的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取20 μl进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到桂皮酸的回归方程为Y=147.23X+4.3834，相关系数r=0.9997，桂皮酸的回归方程为Y=103.75X+11.1370，相关系数r=0.9992，结果表明桂皮酸在 2.024～12.144 μg/ml，桂皮醛在 8.480 ～ 50.880 μg/ml与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 专属性考察:分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照样品溶液各20 μl进样，分别记录其色谱图。在“2.2”色谱条件下，供试品中桂皮酸和桂皮醛的色谱峰与对照品中这两种成分的色谱峰保留时间均一致，桂皮酸和桂皮醛与样品中其他成分分离度均大于1.5，且阴性样品溶液中在相应的位置没有色谱峰干扰，由此表明本方法的专属性良好。见图1～3。

图2 供试品溶液色谱图1:桂皮醛;2:桂皮酸

图3 阴性样品溶液色谱图

2.3.4 精密度试验:取含有桂皮醛6.072 μg/ml和桂皮酸25.440 μg/ml的对照品溶液连续进样5次，分别记录其峰面积，测得桂皮醛的 RSD=1.19%(n=5)，桂皮酸的 RSD=1.05%(n=5)。

2.3.5 重复性试验:取同一批(批号091403)样品溶液按2.2项下色谱条件，1 d内平行操作6份，测得桂皮酸的含量 RSD=1.06%(n=6);桂皮醛的含量RSD=0.95%(n=6)，结果显示方法的重现性良好。

2.3.6 稳定性试验:取质量浓度为4 g/L(批号091403)样品溶液按2.2项下色谱条件，分别于1、2、4、8、16、24 h进样测定，共测6次，求得桂皮酸的峰面积RSD=1.19%(n=6)，桂皮醛的峰面积 RSD=1.30%(n=6)，结果表明样品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 检测限和定量限:取含桂皮酸2.024 μg/ml的标准液和桂皮醛8.480 μg/ml的标准液，分别逐级稀释，以信噪比(S/N)3确定检测限，以信噪比(S/N)10确定定量限，桂皮酸和桂皮醛的定量限分别为0.025，0.1 μg/ml;桂皮酸和桂皮醛的定量限分别为0.15，0.2 μg/ml。

2.3.8 加样回收率试验:精密称取已测定含量的柴胡桂枝颗粒(批号091403)样品6份，每份0.25 g，分别精密加入浓度为0.253 mg/ml桂皮醛对照品贮备液及浓度为1.060 mg/ml桂皮酸对照品贮备液各1 ml，按2.2项下色谱条件进样20 μl，记录峰面积，计算平均回收率，测得桂皮酸的平均回收率为99.73%，RSD=1.83%(n=6);桂皮醛的平均回收率为100.09%，RSD=1.39%(n=6)。见表1。

表1 桂皮酸和桂皮醛的回收率

2.4 样品的测定 取4个不同批号的柴胡桂枝颗粒，按2.1.2项下处理，依照2.2项下色谱条件下进行含量测定，每份样品重复进样3次，计算平均值。见表2。

表2 桂皮酸和桂皮醛的含量测定结果

3 讨论

实验中采用的色谱条件是参考《中国药典》2010版“桂枝”含量测定项下的流动相为:乙腈:0.1%冰醋酸(33∶67)［25］，但是抑制拖尾效果不是很明显，而且桂皮酸和桂皮醛的分离度不理想，故而在此基础上稍作了调整，流动相定为:乙腈:1.0%冰醋酸(30∶70)。

本实验考察了超声提取法和回流提取法对样品中桂皮酸和桂皮醛含量的影响，结果发现两种提取方式得到的桂皮酸含量相差不大，但是桂皮醛的含量差异很大，超声提取法得到的桂皮醛含量较高，所以确定提取方式为超声提取。在对样品中桂皮酸和桂皮醛的提取条件的考察中分别对甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇几种提取溶剂进行了分析比较，结果显示甲醇提取的桂皮酸含量最高，70%甲醇提取的桂皮醛含量最高，但是甲醇和70%甲醇提取的桂皮醛的含量相差不大，因此选择甲醇作为提取溶剂。

提取溶剂的体积也较大程度地影响提取效果，因此对提取溶剂的体积进行了考察，分别采用10、25、40 ml的甲醇溶液对样品进行超声提取，结果显示25 ml和40 ml甲醇溶液提取出的桂皮酸和桂皮醛的含量相差不大，因此选择25 ml作为提取溶液的体积。及此外又对超声提取的时间进行了考察，比较了提取20、30、40 min桂皮酸和桂皮醛的含量，结果显示提取30 min和40 min两种成分含量没有太大区别，所以提取时间定为30 min。

采用HPLC法对柴胡桂枝颗粒中桂皮酸和桂皮醛的含量进行测定，方法学研究结果表明此方法简单可行，准确度和灵敏度高，重复性好等指标均符合要求。

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