线虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展

陈玉艳，胡长志，崔汝强（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

线虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展

陈玉艳，胡长志，崔汝强*
（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase， AChE， EC 3.1.1.7）是生物神经传导中的一种关键性酶。它可以降解胆碱能突触间的乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，从而保证神经信号在生物体内的正常传递。分析线虫乙酰胆碱酯酶基因的特征，介绍已报道的线虫AChE 基因的特点和功能，对线虫AChE基因研究中存在的问题和前景进行分析和展望。

线虫；乙酰胆碱酯酶；乙酰胆碱酯酶基因

陈玉艳， 胡长志， 崔汝强. 线虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展［J］. 生物灾害科学， 2015， 38（4）:284-289.

线虫属于线形动物门的线虫纲，广 泛分布于自然界中。人 们最早发现的线虫是人和动物的寄生线虫，随后才发现了植物寄生线虫。如今植物寄生线虫已是世界农作物的重要病原物之一，至 2003 年，有人统计平均每年全世界农作物因植物寄生线虫危害造成的损失高达 1 250 亿美元［1］。随着人们对植物寄生线虫研究的深入，与线虫运动相关的基因渐渐成为关注的焦点。

线虫的运动是由线虫体壁纵肌收缩及角质层的弹性改变共同完成的；假体腔充满体腔液，在膨压的作用下形成一个支撑和传送肌肉收缩的流体静力学支架，使线虫不能伸缩运动，只能表现出身体背腹方向的蛇行运动。同时，在线虫的背、腹神经索存在着神经-肌肉突触，由兴奋性神经递质乙酰胆碱（ACh）来调节它们的肌肉活动［2］。乙酰胆碱主要存在于突触前的胆碱能神经末梢部位，是胆碱和乙酰辅酶 A在胆碱乙酰移位酶（胆碱乙酰化酶）的催化作用下合成的。线虫的胆碱能系统一直是许多控制动物和植物寄生线虫的化合物靶标，而作用于这个系统的化合物大多针对的是乙酰胆碱酯酶［3］。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是大多数生物神经传导中的一种关键性酶。该酶的“经典”功能是在胆碱能突触通过水解乙酰胆碱来终止该类神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内正常传递［4］。 正是 AChE 这种“经典”功能，使 AChE 成为目前世界上施用最广的氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂的作用靶标［5］。此外，AChE 基因也能在非神经组织中表达，具有一些与神经冲动传递无关的“非经典”功能［6］。例如，AChE 在诱导轴突生长、突触形成、凋亡、促进造血细胞形成和免疫反应等起作用［7］。深入了解 AChE 基因功能对开发新的植物寄生线虫防治策略有着重要意义。

1　线虫AChE的研究

乙酰胆碱酯酶（AChE）最初是在蛔虫（Ascaris）中描述的，后来才在线虫中发现［3］。 在对蛔虫的研究中表明，蛔虫运动的3种神经元，具有显著的乙酰胆碱转移酶活性，这也暗示了乙酰胆碱酯酶的功能［8］。 乙酰胆碱酯酶以可溶形式出现在胆碱能神经末端，起到调节游离乙酰胆碱浓度的作用。对线虫组织化学染色和适当透化后，发现乙酰胆碱酯酶在靠近神经环和纵神经索附近有着广泛的肌肉神经位点［9］，这表明乙酰胆碱酯酶与线虫的肌肉运动有关。如果线虫肌肉处于过度收缩，一些氨基甲酸酯类和有机磷类的乙酰胆碱酯酶抑制剂会使秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）瘫痪。研究发现 AChE 普遍存在于寄主中，在不同的寄主中其功能也不同，动物寄生线虫分泌的 AChE，负责减少寄主肠道的运动性能，而植物寄生线虫分泌的乙酰胆碱酯酶是调节寄主的抗性和免疫反应。乙酰胆碱酯酶也存在于一些线虫的食道腺及排泄系统中，如锡兰钩口线虫（Ancylostoma ceylanicum）、马来丝虫（Brugia malayi）、胎生网尾线虫（Dictyocaulus viviparous）、巴 特斯细颈线虫（Nematodirus battus）、巴 西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）和毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）等等［9］。

上海交通大学 Wu等［10］2 008 年通过诱导毕赤酵母（Pichia pastoris）表达获得了一种新型重组黑腹果蝇（ Drosophila melanogaster）的 乙酰胆碱酯酶（ R-DmAChE），证 明它比从电鳗（ Electrophorus electricus）、巴西日圆线虫（N. brasiliensis）和人类得到的 AChE 更具敏感性。Li Bing等［11］从家蚕（Bombyx mori）中克隆了Bm-AChE-1和Bm-AChE-2两种基因，毒 扁豆碱和对氧磷对其抑制作用的研究结果表明，A ChE-2 比 AChE-1 更敏感。将接触辛硫磷的家蚕的两种 AChE 基因进行克隆表达，发现Bm-AChE-1 在大脑、脂肪、中 肠和丝腺组织中的表达均高于 Bm-AChE-2，这 一结果揭示了在家蚕正常的生理作用和代谢过程中，Bm-AChE-1可能具有更重要的地位。在研究中还发现，辛硫磷一旦被家蚕的中肠吸收，会抑制 AChE 的活性，从而抑制了 Bm-AChE-1 和Bm-AChE-2 的表达，这将影响突触神经元传导，导致家蚕生理障碍［12］。将南方根结线虫（Meloidogyne incognita）和爪哇根结线虫（M. javanic）的乙酰胆碱酯酶同电鳗的乙酰胆碱酯酶进行灵敏性比较，发现南方根结线虫和爪哇根结线虫对各种抑制剂均表现出相似的灵敏度，而来自电鳗的乙酰胆碱酯酶则对苯线磷和涕灭威更为敏感，对灭克磷和毒扁豆碱不太敏感［12］。 上述所有的证据表明，至少有一些 AChE 在生物的发育及运动过程中起着重要作用。

2　线虫AChE分子型

人们在动物中发现，一些乙酰胆碱酯酶或真性胆碱酯酶有着不同的分子形式［13］。它们以非对称（A）的形式和球状（G）的形式出现，其中，A形式以 A4，A8 和 A12 的形式出现；G 形式以 G1，G2 和 G4的形式出现，对应酶催化亚基的单体，二聚体和四聚体。事实上，在很长时间内人们认为线虫只有单一的分子型。但是后来通过对自由生活线虫秀丽小杆线虫和植物寄生物种南方根结线虫和大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）等线虫的研究表明，线虫 AChE 不具有其他动物种类中常见的、与许多 AChE 有关的胶原尾，而是球状单体（G1）、二聚体（G2）和四聚体（G4）。并且球状单体（G1）和二聚体（G2）这两种蛋白质的分子量，大约分别为 80和 189 kDa［13］。依据其溶解性又可分为两亲分子和非两亲分子，这些分子型又组成了不同类型的 AChE，并由多种基因编码，其编码的不同类型在底物的亲和力，大小，洗涤剂灵敏度以及对抑制剂的感应等方面均有很大的差别［3］。在 桑蚕 AChE 基因的分子特征研究中发现，Es-AChE 和 Bm-AChE2 的同一性为 58%，Es-AChE 和 Bm-AChE1 的同一性仅为 36%，说明寄生虫和寄主的 AChE 氨基酸序列有很大不同［14］。

许多动物寄生线虫能通过侧腺活跃地分泌 AChE。这些分泌的 AChE 与神经—肌肉突触间的 AChE有着明显的差异。秀 丽小杆线虫、南 方根结线虫及大豆胞囊线虫等线虫均含有三个活跃的乙酰胆碱酯酶，可被分成两类，是对应于其他线虫物种的 A和 C 类［3，15］。 C 类 AChE 可能发生在秀丽小杆线虫的一对与排泄管有关的神经元——CAN 细胞，相比之下，A类和 B 类主要发生在背侧和腹侧的神经肌肉接点［15］。这些酶类在线虫体内的多少和分布可能是影响抑制剂对线虫行为作用的重要因素。乙酰胆碱酯酶的分布与定位在线虫的恢复过程中也起着重要的作用，同时线虫分泌的乙酰胆碱酯酶的分子形式不同也可能会造成不同的效应［3］。

3　线虫AChE基因型

1986 年，人们从果蝇（Drosophila）和黑腹果蝇（D. melanogaster）中克隆到第一个昆虫乙酰胆碱酯酶基因，当时将它划分为ace-2一组［16］。 随后，又在库蚊（Culex pipiens）中发现了编码AChE的两种基因，之后才在其它蚊类中发现［17］。 疟蚊（Anopheles gambiae）和棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）［18］都有两个 AChE 基因，其中，疟蚊（A. gambiae）的 ace-1 对有机磷类杀虫剂有抵抗力，因此选择受到抑制；a ce-2 是性连锁基因，只 是它的具体功能仍未知［16］。并 且，通 过酶学测定法检测不到 ace-2 中的 AChE活力，表明 AChE 酶活性要么很低，要么范围很小，因而估计 ace-2 在突触 AChE 中起很小的作用［19］。有研究发现，苍蝇中的 ace-2 基因只编码其主突触功能基因，但在其它昆虫中并非如此［17］。最近 ace 基因在疟蚊、伊蚊（Aedes aegypti）、库蚊、黑腹果蝇中的克隆与序列分析，提供了一个在基因水平上与其它蚊类物种比较的新机会［19］。

线虫与昆虫不同，多数昆虫 AChE 是单基因编码，而线虫 AChE 由多基因编码。近年来对多种线虫尤其是以秀丽小杆线虫为模式物种，对 AChE 的相关基因进行克隆和研究，揭示了结构和组织分布，并推测其分别演绎的功能。对秀丽小杆线虫中乙酰胆碱酯酶的缺失突变体进行遗传分析，发现乙酰胆碱酯酶类线虫有四个无关联结构基因（ace-1， ace-2， ace-3 和 ace-4）［20］。除 ace-4外，其它三个基因分别编码A类型、B 类型和C类型的AChE，在 染色体X上的ace-1编码AChE-1，染 色体I上的ace-2编码AChE-2，染色体Ⅱ上的 ace-3 编码 AChE-3［3］。 编码秀丽小杆线虫 AChE-1 的 ace-1 主要分布在线虫的体壁肌细胞。AChE-1 是一个两亲分子四聚体，具有一疏水的非催化亚基，与脊椎动物的 AChE 催化亚基 AChE（T）相类似，并在花生根结线虫（M. arenaria）和南方根结线虫中发现该亚基［21］。对于秀丽小杆线虫这个各个阶段均是移动的自由生活线虫，ace-1的表达在幼虫阶段达到一个最大值［22］。秀丽小杆线虫的 ace-2是一种结合有糖基磷酯酰肌醇结构的两亲分子二聚体。其 C 末端是疏水的，与脊椎动物 AChE（H）结构非常相似，都有一个 GPI 锚定位点。秀丽小杆线虫、南方根结线虫和胎生网尾线虫的 AChE-2 在 C 末端均有一个自由的半胱氨酸残基，位 于锚定位点的上游并参与链间二硫键的形成［23］。秀 丽小杆线虫的 ace-3 和 ace-4两基因均位于染色体Ⅱ，其间有 356 个核苷由 ace-4的终止密码子和 ace-3 的启始密码子分离开来。AChE-3 与 GPI 结构相结合成两亲分子二聚体［24］。尽管从秀丽小杆线虫中分离了 AChE 的类型 D，但 ace-4的功能仍然不确定，这也为后人研究其他相关基因奠定了基础。

任何单一类乙酰胆碱酯酶的缺失突变对线虫没有明显的表型行为效应；其中，缺乏 AChE-1 和AChE-2 突变株出现行为不协调，但发育正常；缺乏 AChE-3 和另外两个基因其中之一，除了后退有点困难，其他行为几乎是正常的；所有这三类的缺失则是致命的。三个可能的双表型突变体揭示了 ACE-1 或ACE-2 是必要的正常运动基因，至少需要这三个功能基因中的一个。三重突变体的生存能力可以通过在该基因编码的突变处掺入还原胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱合成酶来鉴定。这些线虫缺少功能性胆碱能系统，虽然行为严重不协调，但它们能够生长和繁殖。在植物寄生线虫中，目前已经克隆的乙酰胆碱酯酶基因包括南方根结线虫的 Mi-ace-1 和 Mi-ace-2，爪哇根结线虫的 Mj-ace-2，甘薯茎线虫的 Dd-ace-1、Dd-ace-2 和Dd-ace-3，马铃薯白线虫（Globodera pallida）的 Gp-ace-2和大豆胞囊线虫的 Hg-ace-2，并对基因的结构功能、表达特性和进化机制等进行了深入研究［25］。 原位杂交的结果表明植物寄生线虫 ace基因在线虫食道腺细胞中表达，但不同的植物寄生线虫中 ace 基因表达的时间和表达的量有明显差异，这说明ace在线虫寄生过程中可能有不同的作用［26］。南 方根结线虫中Mi-ace-2在线虫的各个虫态均表达，在二龄幼虫和雌虫的表达量高于雄虫和卵；大 豆胞囊线虫中 Hg-ace-2 主要在卵和寄生早期的二龄幼虫中表达［27］。 对乙酰胆碱酯酶基因的研究，英国洛桑实验站的 Dong等人［18］2 005 年已经从棉蚜和桃蚜体内克隆了 ace-1 和 ace-2，并且将其命名为果蝇直系同源 ace-2 和突触基因 ace-1。在双翅目蝇类，例如果蝇、黑腹果蝇、铜绿蝇（Lucilia cuprina）、橄榄果实蝇（Bactrocera oleae）和家蝇（Musca domestica）等等中仅仅只有 ace-2 类型的基因［14］。 通过在体外表达蚜虫的 ace-1 和 ace-2 试验表明，ace-1 主要是编码棉蚜的突触乙酰胆碱酯酶［18］。 关于国内的研究，丁中等［23，28-29］从甘薯茎线虫中克隆了 3 个乙酰胆碱酯酶基因（Dd-ace-1， Dd-ace-2 和 Dd-ace-3）。熊玉芬等［25］通过分离江苏省连云港市松树萎焉病病死松树的氨基酸序列比对和同源性分析显示，松材线虫 Bx-ace-2 编码的乙酰胆碱酯酶与已报道的秀丽小杆线虫AChE-1、AChE-3 和 AChE-4 型乙酰胆碱酯酶的相似性为 28%～31%，而与秀丽小杆线虫 AChE-2 及甘薯茎线虫、南方根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯白线虫和胎生网尾线虫的 AChE-2 型乙酰胆碱酯酶的氨酸序列相似性为 44%～52%。构建的系统进化树也显示，松材线虫乙酰胆碱酯酶与其他线虫 ACE-2 型乙酰胆碱酯酶具有相对更近的遗传距离，因此推测该松材线虫乙酰胆碱酯酶也属于 ACE-2型。由于线虫存在多种基因编码 AChE，克隆 AChE 基因显得尤为重要。

4　线虫AChE药理学特性

乙酰胆碱酯酶是维持神经系统正常功能的关键性酶，多年来一直是农药毒理学研究的重点之一。乙酰胆碱酯酶原来是治疗寄生虫病的重要靶标，如今抗胆碱酯酶类农药被广泛用于害虫防治。由于这些化合物（一般是有机磷和氨基甲酸酯类）相关的毒性，导致它们在许多国家限制使用［30］。 同时，该类杀虫剂的广泛使用导致大量农林害虫产生了明显的抗药性［4］。 例如，秀丽小杆线虫经氨基甲酸酯类和有机磷类杀线剂处理 24 h后，线虫的 AChE 活性恢复迅速，其中涕灭威处理过的线虫经 24 h恢复期后，线虫的AChE 活性几乎完全恢复，但经苯线磷处理的线虫经24 h恢复期后，与未经药剂处理的线虫相比，仅恢复约 10%的 AChE 活性，但这样小量的 AChE 活性己足以使线虫恢复正常活动［3］。鉴定表明，胞囊线虫对氨基甲酸酯类和有机磷类杀线剂的敏感性要比根结线虫低［15］。当前防治甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）的主要药剂为 AChE 抑制剂，如涕灭威、灭线磷等，由于这些杀线剂毒性高对环境污染大，不可持续使用。因此，开展对植物寄生线虫 AChE 的研究，既有助于深入了解线虫 AChE 的特性，又可以进一步开发新的防治途径和方法。值得注意的是，在这些化合物中差别很大的结构和非共价键，通过不同酶的位点，提供许多不同的起始作用，暗示了在未来的药物设计研究中这是一个富有成效的领域。

目前，检测到编码胆碱能突触的 AChE 基因，可以识别耐药菌株的突变点，减少靶标的敏感性，从而赋予杀虫剂耐药性［19］， 这有利于今后的研究。乙酰胆碱酯酶为防治寄生线虫提供了重要的神经肌肉靶标，通过它人们有可能开发出更多的选择性抑制剂。例如，乙酰胆碱酯酶复合使用抑制剂用于阿尔茨海默氏病（Alzheimer disease，AD）的治疗最近已取得了较好的进展。研究发现，双位点作用的 AChE 含有两个重要的结构域：一个是位于活性口袋底部的催化位点（catalytic anionic site，CAS），由 Ser200、His440 和 Glu327 组成；另 一个是位于入口处，以 Trp279 为中心的外周阴离子位点（ peripheral anionic site，PAS）。经典的乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEIs）多作用于 AChE 催化位点，通过抑制乙酰胆碱水解来提高 AD 患者脑内的 ACh 水平，达到改善其学习记忆能力和认知水平的治疗目的［31］。因此，筛选具有较好活性的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI），发现高活性的先导化合物，并且通过进一步的结构改造与修饰，从而开发出治疗 AD 的药物，对人类社会的发展具有重要意义［32］。这类药物对人类健康的影响远远大于对动物健康的影响，并有可能针对乙酰胆碱酯酶这类新靶标开展深入研究。

5　展　望

线虫基因组的研究促进了线虫 AChE 基因的研究，包括线虫 AChE 基因的克隆、表达与纯化、结构与功能的分析，但对植物寄生线虫 ace 调控和分子进化研究还处于起始阶段。尽管知道了植物寄生线虫AChE 为多基因编码，但其实质以及它们的生物学意义仍不清楚。这些研究推动了昆虫靶标抗性分子遗传的研究。鉴于对植物寄生线虫 ace 的调控机理研究较少，虽然有些抗性害虫的 AChE 已被证实对杀虫剂敏感度下降，却仍未发现有ace 突变的现象，目前无法进行解释［33］。

乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，它与有机磷农药有特异反应［34］。针对AChE 利用基因工程技术进行有机磷农药的快速检测、人类疾病防治、生态环境保护和害虫的抗药性等方面的研究具有非常重要的意义［35-36］。 随着 x-衍射技术、原子力学显微技术、基因工程定点突变技术、计算机模拟技术等的发展，相信在不久的将来，在 AChE 的结构和功能的研究、AChE 的遗传学研究以及不同生物 AChE 的分子生物学机制研究等方面必将取得新的成果。但是，由于当前 AChE 的研究重点主要集中在生化毒理学、神经生物学和药理学方面，确切地说，主要集中在昆虫抗药性、人类疾病防治等研究领域，而在环境保护以及植物寄生线虫病害的防治方面却很少涉及。因此，如果要想 AChE 在农业病虫害防治方面发挥更大的作用，就必须深入开展AChE 基因的相关研究，运用这些技术获得有效的现实意义。

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Research Advances of Acetylcholinesterase Genes from Nematodes

CHEN Yu-yan， HU Chang-zhi， CUI Ru-qiang*
（College ofAgronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Acetylcholinesterase（AChE， EC3.1.1.7）is a key enzyme in biological nerve conduction. Between cholinergic synapses， the enzymatic degradation of acetylcholine could terminate the effects of neurotransmitters epicuticular on postsynaptic membrane excitation， so as to ensure the neural transmission of nerve signals in vivo. The gene characteristics were discussed， and all the structure characteristics and the function of the ace genes from nematodes reported were also discussed in this passage. Finally， the problems and prospects in the studies of nematode ace were also analyzed.

nematodes； acetylcholinesterase； acetylcholinesterase genes

S763.3

A

2095-3704（2015）04-0284-06

2015-10-10

国家自然科学基金项目（31260423）和江西省研究生创新项目（YC2014-S198）

陈玉艳，女，研究生，主要从事植物病原线虫学研究，E-mail:646816329@qq.com；*通信作者：崔汝强，副教授，博士，E-mail:cuiruqiang@jxau.edu.cn。