附子注射液对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织的影响

裴河欢，唐汉庆，李晓华，李克明，朱晓莹

(1．钦州市中医药研究所，广西钦州 535000;2．右江民族医学院，广西百色 533000)

附子注射液对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织的影响

裴河欢1，唐汉庆2△，李晓华2，李克明2，朱晓莹2

(1．钦州市中医药研究所，广西钦州 535000;2．右江民族医学院，广西百色 533000)

目的:观察附子注射液对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织的影响，为附子的拓宽应用提供实验学基础资料。方法:60只清洁级Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、附子注射液低剂量、中剂量、高剂量组、雌二醇组6组，模型组、低剂量、中剂量、高剂量组、雌二醇组切除卵巢。低剂量、中剂量、高剂量组、雌二醇组再分别以附子注射液尾静脉注射(iv)，正常组、模型组则分别给予同体积的生理盐水。检测血清钙、磷、骨密度(BMD)、子宫质量指数、骨小梁厚度、骨小梁间距并观察骨形态学变化。结果:与正常组比较，模型组血清钙、磷水平、骨小梁间距均显著升高，而BMD、子宫质量指数、骨小梁厚度均显著降低。与模型组比较，高剂量组、雌二醇组血清钙、磷水平、骨小梁间距均降低，而BMD、骨小梁厚度升高，且雌二醇组子宫质量指数显著升高。结论:附子注射液和雌二醇均能改善骨质疏松症，其中高剂量附子注射液对子宫的刺激作用较雌二醇温和，其机制需要更多实验研究。

附子注射液;骨质疏松症;卵巢切除术;骨密度

中医学认为，附子具有补火助阳、温肾散寒等功效，对心脾肾阳虚证均具有振奋作用，是助阳名药。对附子的研究以往多集中于心血管系统。近来有研究［1］表明，其功效的发挥与垂体-肾上腺-性腺轴有联系。骨质疏松症(osteoporosis，OP)以低骨量、骨组织的微观结构损害为特征，是造成骨折的高风险因素之一，被认为是一种起病隐匿的慢性病。［2］37如何进行有效的防治是值得探讨的课题。根据中医学“肾主骨”的理论述说，参考有关附子等补阳方剂与垂体-肾上腺-性腺轴的研究［3-4］，我们推测附子温肾助阳作用也有可能对骨组织代谢有一定的影响。鉴于去卵巢动物骨质疏松模型与临床绝经后骨质疏松症表现相似度较高，这一造模方法目前也比较得到认同［5］，因此我们试图建立大鼠骨质疏松模型，以附子注射液作为干预药物观察其对模型大鼠骨组织的影响，为附子拓宽应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级Wistar雌性大鼠60只，体质量210～260 g，本院科学实验中心提供(动物合格证号SCXK(桂)2012-0007)。

1.1.2 药物和试剂 附子注射液(自制);戊巴比妥钠(批号20110621，北京化学试剂公司);雌二醇注射液(批号080401，上海通用药业);血清钙试剂盒(批号00321101，北京博奥公司);磷试剂盒(批号120343121，北京博奥公司)。

1.1.3 仪器 普利赛斯电子天平(XT220A型，上海麦聚瑞电子仪器有限公司);生物显微镜(DM1000，莱卡);电脑快速恒冷冷冻石蜡两用切片机(KD-2258-VI型，浙江科迪);高速低温离心机(PK121R型，ALC公司);双能X线骨密度测定仪(DCS-600R型，Aloka，Japan);中草药粉碎机(DXF-1000A型，广州大祥);智能放免测量仪(SN-695B型，上海核所日环光电仪器有限公司);自动生化分析仪(RTX-90，Beckman，USA)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和造模 60只清洁级Wistar雌性大鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分为正常组、模型组和附子低、中、高剂量组、雌二醇组6组各10只。其中模型组、附子低、中、高剂量组、雌二醇组均施行卵巢切除手术［6］:仰卧位2%戊巴比妥钠大鼠腹腔注射(40 mg·kg－1)麻醉，严格无菌操作下正中腹部切口，钝性分离肌肉组织和腹膜，沿输卵管上行查寻卵巢，应用7号手术缝线在输卵管壶腹处进行结扎，完整切除双侧卵巢后撒上青霉素粉，缝合皮肤并消毒伤口。正常组手术路径相同但不切除卵巢，只用镊子轻轻夹出卵巢再送回缝合关腹。术后均连续灌服青霉素3 d，以预防感染。术后均普通饲料喂养，自由饮水。术后恢复2周后附子低、中、高剂量组和雌二醇组分别以附子注射液(5、10、20 g·kg－1)、雌二醇注射液(0.05 g·kg－1)尾静脉注射(iv)，正常组、模型组则分别给予同体积生理盐水。每天1次，连续静脉注射8周。8周后第1天禁食12 h取材检测。

考虑到附子对心血管系统的副作用，对附子注射液剂量我们参考研究确定的静脉注射半数致死量(LD50)［7］和研究［8］单体药物人体实验与动物实验给药剂量间等效剂量情况进行折算而确定，将附子注射液剂量定在安全范围内。对雌二醇计量参考研究［8］而确定。

1.2.2 附子注射液制备 熟附片由本校药理教研室提供并鉴定。参考沈阳药学院药物制剂组《常用药物制剂》酒精沉淀法制备100%附子注射液，即每100 mL中含有100 g生药成分。

1.2.3 血清钙、磷测定 心脏取血5mL离心(4℃，2000 r·min－1，10 min)取上清液，－80℃保存，分别按照试剂盒说明书进行操作检测。

1.2.4 骨密度(bone mineral density，BMD)测定 应用双能X线骨密度测定仪和软件进行大鼠左股骨扫描并测定BMD值。

1.2.5 子宫质量指数测定 取材前大鼠称重，处死后取大鼠子宫，轻压挤出子宫液体，滤纸吸干称重。为避免大鼠个体质量差异对实验的影响，以子宫质量指数为指标，按下列公式计算:子宫质量指数=大鼠子宫质量/大鼠质量。

1.2.6 骨组织形态学观察 大鼠处死后取右股骨，剔除肌肉筋膜组织称重，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA-2Na溶液脱钙4周，pH7.4的PBS冲洗2次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、组织切片厚度5 μm，HE染色，生物显微镜、自动图像分析仪观察并拍片，进行骨组织计量分析，计算骨小梁厚度和骨小梁间距。

1.2.7 统计学方法 采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠术后2～3 h后意识完全清醒，可正常进食。48 h后切口无红肿，可正常活动，72 h后切口无感染。全部大鼠2周后切口均I期愈合，实验中途没有死亡脱失，均纳入统计分析。

2.2 大鼠血清钙、磷、BMD及子宫质量指数测定

表1显示，与正常组比较，模型组血清钙、磷水平均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，而BMD及子宫质量指数均显著降低，差异也有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，低剂量、中剂量组钙、磷水平均降低，BMD及子宫质量指数均升高，但差异无统计学意义(P均＞0.05)，而高剂量组血清钙、磷水平均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01);BMD显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，子宫质量指数也升高，但差异无统计学意义(P﹥0.05)。与模型组比较，雌二醇组血清钙、磷水平均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，而BMD升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，子宫质量指数显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。高剂量组和雌二醇组各项指标比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 血清钙、磷、BMD及子宫质量指数比较(±s)

表1 血清钙、磷、BMD及子宫质量指数比较(±s)

注:与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组 别 例数 剂量/g·kg－1血清钙/mmol·L－1血清磷/mmol·L－1BMD/g·cm2子宫质量指数正 常 组 10 —2.76±0.54 1.87±0.84 0.94±0.04 0.23±0.02 模 型 组 10 — 5.56±0.892)4.58±0.922)0.18±0.012)0.09±0.012)低剂量组 10 5 4.18±0.66 4.22±0.81 0.23±0.05 0.13±0.02中剂量组 10 10 4.09±0.72 3.86±0.86 0.34±0.06 0.14±0.01高剂量组 10 20 2.98±0.524)2.03±0.764)0.88±0.044)0.16±0.04雌二醇组 10 0.05 2.82±0.494)2.45±0.684)0.76±0.053)0.34±0.054)

2.3 大鼠骨小梁厚度、骨小梁间距测定结果

表2显示，与正常组比较，模型组骨小梁厚度显著减少，骨小梁间距显著增大，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，低剂量、中剂量组骨小梁厚度增大，骨小梁间距减小，但差异无统计学意义(P均＞0.05)，而高剂量组骨小梁厚度显著增大，差异有统计学意义(P＜0.01)，骨小梁间距减小，差异也有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，雌二醇组骨小梁厚度增大，差异有统计学意义(P＜0.05);骨小梁间距减小，差异也有统计学意义(P＜0.05)。高剂量组和雌二醇组骨小梁厚度、骨小梁间距比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 骨组织形态学观察

正常组股骨骨小梁粗壮，分布均匀密集，形态结构完整，连接成网状，骨髓细胞较多，腔大小正常。模型组骨小梁稀疏、断裂，排列杂乱，骨髓腔扩大，有空泡存在。

低剂量、中剂量组骨小梁稀疏、断裂，也有空泡存在，而高剂量组和雌二醇组骨小梁排列致密，骨髓腔骨髓细胞较多(见图1～6)。

表2 骨小梁厚度、骨小梁间距比较(±s)

表2 骨小梁厚度、骨小梁间距比较(±s)

注:与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组 别 例数 剂量/g·kg－1骨小梁厚度/mm骨小梁间距/mm正常组 10 —42.52±6.82 0.16±0.02模型组 10 — 20.22±3.342)0.36±0.062)低剂量 10 5 22.87±4.56 0.34±0.08中剂量 10 10 26.78±5.16 0.32±0.05高剂量 10 20 50.65±8.844)0.21±0.043)雌二醇 10 0.05 38.36±6.223)0.22±0.033)

图1 正常组(HE×100)

图2 模型组(HE×100)

图3 低剂量组(HE×100)

图4 中剂量组(HE×100)

图5 高剂量组(HE×100)

图6 雌二醇组(HE×100)

3 讨论

去卵巢动物骨质疏松模型与临床绝经后骨质疏松症表现吻合度较高，骨代谢的正常是骨吸收和骨形成2个过程维持平衡的结果［9］，这2个过程与破骨细胞和成骨细胞的功能状态相关，如果破骨细胞功能亢进，增加对骨的吸收，从而引起骨中钙磷的流失，导致骨矿物质的减少，表现为BMD的减小、血清钙磷水平的升高［10］。研究［11-12］已表明，卵巢切除后引起大鼠骨量减少，是由于雌激素不足引起破骨细胞功能相对亢进、骨吸收大于骨形成而致。

在本实验中我们观察到，与正常组比较，模型组血清钙、磷水平均显著升高，而BMD显著降低，骨小梁厚度显著减少，骨小梁间距显著增大。骨形态学也观察到，骨小梁稀疏、变细，排列杂乱，骨髓腔扩大，说明模型组雌激素不足出现骨代谢异常表现。采用附子注射液和雌二醇干预后，上述指标或异常表现在一定程度上得到纠正或恢复。这一效果与附子注射液的剂量有关。低剂量和中剂量组改善效果不明显，而以高剂量组改善效果显著，使各项指标接近或趋向正常组水平，提示单味中药如果要临床取效可能需要较大用量，这与一些中药复方的效果好、用量精有不同之处［13］，推测与中药复方作用于多环节和多通路有关。

附子注射液和雌二醇均能改善骨质疏松症骨组织异常表现，但两者的作用还稍有不同。单就本实验工作而言，我们注意到与模型组比较，雌二醇组子宫质量指数显著升高，附子注射液3个剂量组尽管子宫质量指数也升高，但与模型组比较差异无统计学意义，说明尽管附子注射液对子宫也有刺激作用，但作用较雌二醇温和。这一点提示我们，长期应用雌激素防治骨质疏松症有可能存在刺激子宫组织增生、有潜在致瘤风险。如果能找到一种对子宫刺激作用微弱而又有效治疗骨质疏松症的药物，就有可能使女性绝经后骨质疏松症的治疗变得更安全有效，并有可能成为长期使用的预防药物。关于附子注射液和雌二醇对子宫不同程度的刺激作用，我们推测可能与雌激素受体不同的亚型有关。研究表明，不同的亚型对子宫的刺激作用不同［14］，因此对于附子注射液是否通过不同亚型起作用值得进一步的探究。

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Effects of aconite injection on bone tissue in osteoporotic rats

PEI He-huan1，TANG Han-qing2△，LI Xiao-hua2，LI Ke-ming2，ZHU Xiao-ying2
(1．Chinese Medical research institute of Qinzhou city，Guangxi Qinzhou 535000，China; 2．Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China)

Objective To observe effects of Fuzi injection on bone tissue in ovariectomized rats with osteoporosis for further applicatioin of Fuzi．Methods 60 clean grade female Wistar rats were randomly divided into control group，model group，Fuzi injection low-dose，middle-dose，high-dose group and estradiol group 6 groups．Model group，Fuzi injecton 3 groups and estradiol group have been ovariectomized to establish model of osteoporosis，and then Fuzi injecton 3 groups and estradiol group respectively were iv Fuzi injection and estradiol．control group and model group were iv the same volume normal saline．To examine levels of serum calcium and phosphorus，bone mineral density(BMD)，uterus index，trabecular thickness，trabecular space and changes of bone morphology．Results:Compared with control group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in model group increased significantly while BMD，uterus index and trabecular thickness reduced significantly．Compared with model group，levels of serum calcium，phosphorus and trabecular space in both high-dose group and estradiol group reduced while BMD and trabecular thickness increased，in additon，uterus index in estradiol group increased significantly．Conclusion:It was suggested that both Fuzi injection and estradiol might improve bone tissue of osteoporosis while high-dose Fuzi injection had a milder stimulating effect on uterus than that of estradiol，whose mechanism was needed more experimental researches．

Fuzi injection;Osteoporosis;Ovariectomy;Bone mineral density

R285．6

B

1006-3250(2015)03-0278-04

2014-11-13

裴河欢(1981-)，男，药师，从事中医药的临床与研究。

△通讯作者:唐汉庆(1976-)，男，副教授，从事中西医结合及民族医药研究，Tel:18978603776，E-mail:phdtanghanqing@ 163．com。