慢性粒细胞白血病靶向治疗相关基因及信号通路*

董 菲 综述，孙成铭 审校

(1.青岛大学 266000;2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院 264000)



·综 述·

慢性粒细胞白血病靶向治疗相关基因及信号通路*

董 菲1综述，孙成铭2△审校

(1.青岛大学 266000;2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院 264000)

慢性粒细胞白血病； 基因； 信号通路； 靶向治疗； 白血病干细胞

慢性粒细胞白血病(CML)是起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，Ph染色体t(9;22)(q34;q11)是其特征性细胞遗传学标志。Ph染色体形成的bcr/abl融合基因编码具有较强酪氨酸激酶活性的蛋白BCR/ABL，通过改变关键的调节蛋白磷酸化状况来影响多种信号传导途径，引起细胞周期紊乱、增殖失控或凋亡受阻，从而导致白血病的发生[1]。CML在临床上可分为慢性期、加速期和急变期，其中急性变是大多数CML患者的转归，而在病程发展中BCR/ABL发挥着关键作用，靶向抑制此蛋白的表达可以有效缓解甚至可以治愈疾病。近年来，针对BCR/ABL的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的临床应用，开辟了CML靶向治疗的新途径，然而，这些药物不能根除白血病，容易引发耐药，寻找新的有效的治疗方法成为目前研究的热点。随着对CML发病机制的不断研究，白血病干细胞(LSC)自我更新与增殖的信号通路中关键靶点的发现改变了人们对CML发病机制、治疗和预后的认识，多靶点、联合用药可能成为治疗CML的关键[2]。

1 CML相关基因及信号通路

1.1 经典信号通路在CML中的作用

1.1.1 Wnt/β-catenin Wnt/β-catenin信号通路在生物进化过程中极为保守，是胚胎发育及肿瘤形成的重要途径。经典Wnt/β-catenin信号通路对于造血细胞的增殖、分化和干细胞自我更新是至关重要的，其异常与恶性血液肿瘤的发展相关[3]。小鼠实验证实，β-catenin的缺失能降低CML干细胞的自我更新能力[4]。在CML急变过程中，Wnt/β-catenin信号通路活性明显增强[5]。Wnt/β-catenin异常激活导致多药耐药相关蛋白ABCB1(ABCB1有排出药物的作用)的过表达，从而使CML患者在加速期易对药物产生耐受[6]。Wnt信号通路抑制剂AV65，能减少CML细胞中β-catenin的表达，抑制原始CML细胞的增殖[7]。

研究显示，过表达的β-catenin能够与肿瘤坏死因子受体CD27及其配体CD70相互作用。小鼠CML干细胞和祖细胞上的CD27与CD70结合诱发Wnt靶基因过表达，促进CML干细胞增殖；而阻断CD27-CD70可导致小鼠CML发展延迟并促进其长期生存。CD27在CML患者骨髓干细胞/祖细胞中有表达，至于CD27-CD70在人CML中的机制目前尚不清楚。这些数据提示免疫系统可能会通过Wnt/β-catenin参与CML的发展。进一步的研究将揭示靶向阻断CD27信号是否会抑制Wnt/β-catenin通路，从而为CML和其他白血病提供新的治疗机会[8]。

1.1.2 JAK2/STAT5 BCR/ABL通过激活JAK2/STAT5通路参与细胞生长、分化和迁移。STAT5作为BCR/ABL磷酸化激活的下游效应分子，在BCR/ABL1+CML中被持续活化，调节下游靶基因如Cyclin D1、Bcl-Xl以及C-myc等的表达来诱导细胞恶性转化；高水平的STAT5 mRNA能介导伊马替尼抵抗，并提示CML 病情进展[9]。实验证实STAT5缺失的小鼠不能形成CML，这提示STAT5可能是CML的致病因素之一[10]。抑制STAT5磷酸化将成为消除LSC的一个有趣的靶点[11]。

BCR/ABL+CML细胞JAK2/STAT5通路异常激活[12]。实验数据表明，JAK2-STAT5信号轴在CML LSCs生存和增殖过程中发挥着重要作用[13]。抑制JAK2可降低BCR/ABL并阻碍其下游信号通路，同时增加TKI对BCR/ABL1的效应[14-15]。但是JAK2在CML中具体作用机制并不十分清楚，也有研究指出JAK2对CML 细胞的生存和维持是非必要的[16]。因此，还需要深入研究JAK2/STAT作为治疗靶点在CML中发挥的作用。

1.1.3 PI3K/AKT/mTor PI3K/AKT/mTor位于BCR/ABL的下游，是与细胞自噬相关的通路，激活后导致Ph+细胞受损性凋亡。PI3K/AKT/mTor是正常造血细胞重要的生存信号通路，调节细胞增殖、分化和生存。在实体肿瘤和恶性血液肿瘤中，该通路基因发生突变，这使其成为了一个具有吸引力的治疗靶点。mTOR位于AKT的下游，是由mTORC1和mTORC2两种复合物构成的丝氨酸/苏氨酸激酶，mTORC1调节细胞周期从G1期向S期转化，mTORC2使AKT磷酸化并达到完全活化[17]。CML患者骨髓细胞中mTOR高表达，用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗K562细胞可干扰细胞增殖并增加细胞凋亡，使G0/G1期细胞增加而S期细胞减少[18]。研究还显示，mTOR可能会成为对IM耐药的CML的治疗靶点。

1.1.4 Sonic hedgehog(Shh) Shh信号通路是与发育相关的保守通路，对胚胎发育和细胞增殖起着关键作用。Shh通路在人类许多肿瘤和肿瘤干细胞的发生、发展、维持中发挥着重要的作用。实验数据表明，在CML中Shh通路的蛋白产物SMO、PTCH1、和GLI1等表达水平升高，且急变期表达水平明显高于慢性期[19]。Shh通路可激活抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl，促进CML干细胞的增殖；环巴胺通过阻断Shh抑制CML干细胞的增殖，尤其是对IM耐药的CML早期患者的疗效好[20]。Su等通过实验发现，Shh和β-catenin通路在CD34+、C-kit+的祖细胞中存在共激活的现象，并进一步证实了在K562细胞中Shh信号通路通过β-catenin发挥作用[21]。

1.2 CML中新的基因及信号通路

1.2.1 C/EBPα CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)是转录因子C/EBPs家族的重要成员，对细胞的增殖、分化、凋亡和代谢过程有着重要的影响。在CML中，bcr/abl通过调控下游基因C/EBPα的表达，使其蛋白表达水平下降[22]。C/EBPα的突变或沉默可以抑制K562细胞分化[23]；稳定转染C/EBPα可降低K562细胞C-myc和CyclinB1的mRNA及蛋白的表达，促进细胞凋亡，并向粒系进行分化[24]。由此可见，C/EBPα作为肿瘤抑制因子对CML的发病和发展起着调控作用，可以通过恢复C/EBPα基因的表达作为CML的治疗靶点。

1.2.2 Per2 Period(per)基因家族是生物钟反馈回路中重要的组成成分，因能调控昼夜节律(24 h)而得名，Per2基因是其中的关键一员。之前对钟基因Per2的研究多集中在如乳腺癌、结直肠癌等非血液肿瘤中[25-26]，近几年来才逐渐有学者将钟基因与血液肿瘤联系起来。研究发现，在CML慢性期和急变期Per2基因表达水平都明显下调[27]。转染Per2可使K562细胞C-myc表达水平下降并加速细胞凋亡；沉默Per2后C-myc表达水平恢复升高[28]。因此，在CML治疗中生物节律基因Per2可能会成为众多靶基因中冉冉升起的新星。

1.2.3 C/EBPα-Per2轴 Gery等的科研团队首次发现在白血病细胞系中C/EBPα可以上调Per2基因的表达；反之诱导Per2基因表达，可能会反馈增强C/EBPα的抗肿瘤效应[29]。对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的研究发现，C/EBPα表达沉默时Per2表达下降，相应肿瘤细胞生长加快[30]。在此基础上，国内研究人员孙成铭等科研团队通过对K562细胞转染外源性C/EBPα发现Per2 mRNA的表达上升，而CyclinB1和C-myc mRNA的表达降低；在成功转染C/EBPα的K562细胞中转入Per2基因的RNA干扰质粒，CyclinB1、C-myc mRNA表达水平明显恢复升高，p53的表达出现下调[31]。这些数据证明了CML中很可能存在C/EBPα-Per2轴，两者共同调控CML。

1.2.4 TGF-β/FOXO/BCL6 FOXO属于转录因子Forkhead家族，BCR/ABL通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，反过来抑制FOXO的表达，对CML细胞产生促增殖和抗凋亡的效应[32]。FOXO对于CML干细胞的维持也很关键，最近的数据显示，TGF-β可抑制AKT的活性、激活FOXO从而促进CML干细胞趋于静止[33]。事实上，FOXO3a缺失结合TGF-β抑制和IM可导致小鼠CML干细胞的损耗，通过抑制TGF-β来影响FOXO通路可能对CML治疗有效[33]。BCL6是FOXO下游重要的效应分子，其抑制剂能够选择性消除静止的CML LSC并增强LSC对TKI的敏感性[34]。这些证据表明，TGF-β-FOXO-BCL6信号通路可能会成为CML潜在的治疗靶点[35]。

1.2.5 Sox4 Sox4是Sox转录因子家族的C亚家族成员，在机体组织不同的发展过程中发挥着至关重要地作用[36]。越来越多的数据表明，Sox4在各种肿瘤中表达升高，包括白血病、结肠癌、肺癌和乳腺癌，暗示着Sox4在肿瘤发展中的基础性作用，然而其在不同肿瘤中的作用还存在着争议[37]。Sox4在TKI治疗的Ph+ALL中高表达，它通过激活PI3K/AKT和MAPK等信号通路影响细胞凋亡，从而与 ALL的临床疗效不佳相关[38]。有研究证明，Sox4在C/EBP突变或沉默的 AML患者中是高表达的，Sox4作为C/EBPα的直接靶标，其表达与C/EBPα活性呈负相关；下调Sox4的表达能够阻碍白血病细胞的自我更新并促进细胞分化[39]。针对Sox4或者受Sox4调节的主要基因的靶向治疗可能会对BCR/ABL+ALL产生一定的效应[40]。本实验室通过对CML患者的研究发现，CML患者骨髓标本中C/EBPα表达水平降低而Sox4表达水平明显升高，两者表达呈负相关。这些试验结果为Sox4成为CML治疗的新靶点提供了有力证据。

2 CML的靶向治疗

Ph染色体形成BCR/ABL的是CML发病的分子基础，目前CML的治疗主要是针对BCR/ABL的治疗。传统的治疗方案主要是以白消安、羟基脲、α-干扰素和高三尖杉酯碱等药物为主，但疗效较小且副作用大，有些药物无法使患者获得遗传学或分子生物学缓解，不能从根本上消除病因。异基因造血干细胞移植则受到年龄与合适供体的限制，移植相关死亡率高且容易复发。因此，CML的治疗急需BCR/ABL的高效靶向药物。

2.1 针对BCR-ABL的激酶抑制剂 针对BCR/ABL融合蛋白的药物TKI的使用开创了CML靶向治疗的先河，TKI可竞争性结合酪氨酸激酶催化部位的ATP结合位点,在细胞水平上抑制 BCR/ABL酪氨酸激酶活性，且对正常细胞不具有杀伤抑制作用，特异性强、不良反应较少。然而，随着第一代TKI伊马替尼的临床应用，患者的耐药现象不断增加。第二代TKI尼罗替尼等解决了部分耐药的问题，但对于BCR/ABL特殊位点的突变仍然不能发挥作用，导致治疗无效或治疗后易复发。

2.2 针对BCR-ABL T315I 突变的治疗药物 由于BCR-ABL激酶结构的不断演变，前两代TKI药物对T315I突变效应甚微，第三代TKI ponatinib(AP24534) 可以显著抑制 T315I 突变[41]。另外，研究发现含T315I突变的CML细胞对激酶抑制剂抵抗，而对STAT5磷酸化抑制剂匹莫齐特(pimozide)敏感，两种药物联合应用可能会加强CML的疗效[42]。

2.3 针对白血病干细胞的靶向药物 众所周知，白血病复发或耐药的根本原因是LSC的存在。尽管TKI是CML治疗的一线药物，在大多数患者中几乎能消除所有的CML细胞，但是对于静止的、未分化的LSC无效[43]。一些在维持造血干细胞的自我更新和增殖方面起重要作用的信号途径如Wnt/β-catenin、Shh、FOXO3a、JAK2 /STAT5等成为了治疗CML的新靶点，并由此而研究出的靶向药物如AV65、AG490、Smo抑制剂cyclopamine等都能起到抑制CML LSC的增殖并促进其凋亡的作用。

3 结语与展望

如上所述，众多信号通路构成了庞大复杂的基因信号网络，共同调控着CML的发生和发展。CML中所有激活的信号通路都汇聚于一个独特的终点：细胞增殖的失控和白血病克隆的扩张。因此，确定关联的信号通路在疾病过程中的作用是研究的重要领域。近年来更是随着对LSC研究的不断发展，针对特异通路或基因的分子靶向治疗逐渐成为CML治疗的主要方向。但有些靶向药物仅在体外进行验证，其体内疗效尚不明确，仍需进一步的临床验证。另外还需解决单个基因或单种药物的实施并未能完全抑制CML及其LSC的实际问题。如何更好地将分子靶向治疗和其他治疗手段结合起来，阻止CML急变甚至逆转急变，以提高疗效、改善患者的生存质量，有待更深入的研究和探索。

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山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011YY064)。

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A

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2015-02-09

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