血吸虫病患者不同胃黏膜病变中Survivin、p53、E-cadherin蛋白表达及临床意义

熊萍香，周玉平，熊江琴，宁 安，周宪民，邹节新，杨德平，林智平，胡美英

(1.南昌市第二医院消化内科，南昌 330003； 2.江西省寄生虫病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大学医学院寄生虫学教研室，南昌 330006)

血吸虫病患者不同胃黏膜病变中Survivin、p53、E-cadherin蛋白表达及临床意义

熊萍香1，周玉平1，熊江琴1，宁 安2，周宪民3，邹节新3，杨德平1，林智平1，胡美英1

(1.南昌市第二医院消化内科，南昌 330003； 2.江西省寄生虫病防治研究所，南昌 330046； 3.南昌大学医学院寄生虫学教研室，南昌 330006)

目的 探讨鄱阳湖区域日本血吸虫病患者Survivin、p53、E-cadherin的表达及其临床病理学意义。方法选择鄱阳湖区域确诊为慢性与晚期血吸虫病患者(151例)的胃黏膜标本(其中萎缩性胃炎49例，胃黏膜异形增生30例，不完全性大肠上皮化生34例，胃癌38例)。应用组织芯片和免疫组织化学S-P法检测Survivin、p53、E-cadherin在正常黏膜、癌前病变、胃癌组织中的表达。结果 Survivin蛋白在正常胃黏膜组织壁细胞可见阳性表达，而其他细胞几乎无表达。Survivin蛋白阳性表达率在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌各组分别为51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)；p53蛋白阳性表达率在正常胃黏膜、萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌各组分别为1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)；E-cadherin蛋白在正常胃黏膜表达率为100.00%，在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌各组胃黏膜组织中阳性率分别为83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)。Survivin、p53、E-cadherin蛋白表达与胃癌的组织分化程度、浸润程度、淋巴结转移及pTNM 分期有关(均P<0.05)。结论 Survivin、p53、E-cadherin蛋白可能参与血吸虫患者胃癌病变的发生发展，可作为较理想的标志物用于胃癌的早期诊断和转移预后的预警。

Survivin； p53； E-cadherin； 日本血吸虫病； 癌前病变； 胃癌

日本血吸虫病是严重危害人类身体健康的寄生虫病。江西省鄱阳湖区是我国血吸虫病重疫区[1-2]。本课题组前期研究资料[3]表明，血吸虫病患者合并胃癌前病变(萎缩性胃炎、胃黏膜异形增生、不完全性大肠上皮化生)的发生率明显高于非血吸虫病患者。由于整个胃癌癌前发展过程是一个非常复杂的由进行性和退行性变化组成的动态过程，研究胃癌癌前和早期的基因变化对于了解该病发生的病理过程、进而提出早期诊断和干预策略有重要意义。

现代肿瘤学认为肿瘤的发生、发展涉及多个基因突变与异常表达。许多癌基因/抑癌基因表达失衡、细胞凋亡调控失衡与肿瘤的发生密切相关，单个肿瘤相关基因发生的分子事件作用有限。Survivin是迄今研究发现最强的凋亡抑制因子，在人体各种肿瘤组织中均有Suvrvini蛋白的过量表达[4-5]。Survivin可能作为一种癌基因，参与肿瘤的发生发展。p53基因是迄今发现的人类肿瘤中最常见的一个突变基因，野生型p53 属于肿瘤抑制基因，而突变型p53 基因抑制细胞凋亡，从而促使细胞恶性转化，允许肿瘤细胞的发生发展[6]。E-cadherin 与肿瘤侵袭和转移的关系是近年来肿瘤侵袭和转移研究的热点。细胞黏附分子E-eadherin蛋白是维持上皮细胞极性及细胞间连接的糖蛋白，其结构和功能的异常可导致细胞间黏附能力减弱，在肿瘤的浸润和转移中发挥重要的作用[7-8]。

本研究将收集到的鄱阳湖区域血吸虫病患者萎缩性胃炎、胃黏膜异形增生、不完全性大肠上皮化生及胃癌组织，利用组织芯片及免疫组织化学染色检测癌基因Survivin、p53、E-cadherin的表达。观察这些基因蛋白在正常黏膜、癌前病变、癌变组织的变化趋势，并分析其与胃癌相关病理参数的关系，以深入而全面地揭示血吸虫病患者合并胃癌及癌前病变复杂的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选取南昌市第二医院消化内科于2009年5月至2012年1月期间收集的鄱阳湖区域确诊为慢性与晚期血吸虫病患者(151例)的胃黏膜标本，男88例，女63例，患者年龄23～78岁，平均56.8岁。所有标本均经病理检查核实，其中萎缩性胃炎49例，胃黏膜异形增生30例，不完全性大肠上皮化生34例，胃癌38例。

选取同一个体胃镜活检取得的正常胃黏膜作为对照。参照国际抗癌联盟(UICC)病理学分类(pTNM)分期系统(2002版)的标准，pTNM分期分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。标本使用均有患者的知情同意和医院伦理委员会批准。所有病理标本均经病理科两位以上医师诊断证实。所有标本均常规用10%中性甲醛固定，石蜡包埋制片。

1.2 组织芯片制作

HE染色、切片后进行组织形态学观察，确定胃黏膜病变组织的典型部位，并在切片上做好标记，将切片与蜡块一一对照，在蜡块相应的典型位置做出标记，制备模板蜡块(2 cm×4 cm)，用针头在空白蜡块上打孔(直径1.5 mm)，并精确地排成微孔阵列。然后用自制特殊针头穿取供体蜡块已标记区域获取圆柱状组织芯，再将组织芯转移到受体蜡块阵列孔内，按照病例编号反复将组织芯整齐有序地安插在空白蜡块中，制成组织芯片蜡块。将组织芯片蜡块以4～6 μm厚连续切片。

1.3 免疫组织化学

制作好的组织芯片采用SP法进行免疫组织化学染色，具体操作按照SP免疫组织化学试剂盒说明书进行。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。兔抗人p53多克隆抗体、兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗E-cadherin及SP免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 结果判定

所有病理切片和组织芯片均由两位有经验的病理科医生在不知病例临床资料的前提下阅片，结果不一致时采取协商统一原则。对每张病理切片在200倍镜下观察4个不同视野。按各种阳性细胞占所得细胞总数的百分比，将其分为4个等级：阳性细胞≤5%为0分，5%<阳性细胞≤25%为1分，25%<阳性细胞≤50%为2分，50%<阳性细胞≤75%为3分，>75%为4分；阳性细胞表达的着色深度按计分方法：基本不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项积分相乘为最终评分。0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+),5～8分为中度阳性(),9～12分为强阳性()。

1.5 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin蛋白在不同胃黏膜病变中的表达

Survivin蛋白在正常胃黏膜组织中仅壁细胞可见阳性表达，而其他细胞几乎无表达。在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌患者的胃黏膜组织中均可见Survivin蛋白不同程度表达。Survivin阳性染色主要定位于细胞质中，部分定位于细胞核中，为粗细不一的棕黄色颗粒。在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌患者的胃黏膜组织中，Survivin蛋白阳性表达率分别为51.02%、58.82%、66.67%、86.84%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 Survivin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病变组织中的表达

2.2 p53蛋白在不同胃黏膜病变中的表达

在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌患者的胃黏膜组织均可见p53阳性表达。p53阳性着色以细胞核为主，呈棕黄色颗粒状。p53在正常黏膜组织、萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌的阳性表达率分别为1.32%、16.33%、58.82%、76.67%、92.11%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 p53蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病变组织中的表达

2.3 E-cadherin蛋白在不同胃黏膜病变中的表达

正常胃黏膜组织E-cadherin蛋白表达阳性率为100%。E-cadherin主要表达在细胞膜，细胞质中有少量表达，呈棕黄色颗粒状。E-cadherin蛋白在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌的阳性表达率分别为83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，各组织间比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 E-cadherin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病变组织中的表达

2.4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表达与胃癌临床病理学参数的关系

Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表达与胃癌临床病理学参数的关系见表4。由表4可见，在胃癌黏膜组织中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白表达与患者的年龄、性别无明显关系(P>0.05)，而与组织学分化、浸润程度、淋巴结转移及pTNM分期有关(均P<0.05)。组织分化程度越低，Survivin蛋白、p53蛋白阳性表达率越高，E-cadherin蛋白阳性表达率越低；有淋巴结转移的病例中，Survivin蛋白、p53蛋白阳性率较高，E-cadherin蛋白阳性表达率低；临床病理分期越晚，Survivin蛋白、p53蛋白阳性表达率越高，E-cadherin蛋白阳性表达率越低，表明Survivin蛋白、p53蛋白高表达，E-cadherin蛋白低表达提示胃癌不良预后。

表4 Survivin、p53、E-cadherin 蛋白表达与胃癌临床病理学参数的关系

表4(续)

3 讨论

血吸虫病与结肠癌、肝癌等相关，已为科学工作者所共识。基于自然与社会诸多因素的影响，鄱阳湖是我国血吸虫病流行最为严重的区域之一。本课题组于2009年1月至2010年1月对鄱阳湖血吸虫疫区6县共19个自然村453例自愿者进行胃镜检查，并且在胃窦、胃角、胃体和球腔等部位的可疑病灶处取材进行病理检查，分析结果发现，血吸虫病患者胃癌的前期病变的发生率明显高于非血吸虫病患者[3]。

胃癌是常见的恶性肿瘤，胃癌的发生发展是个多阶段过程，涉及许多基因突变与异常表达，并与细胞凋亡调控失衡相关。由于单一肿瘤标志物检测往往意义较小，难于全面评估。组织芯片为病理学提供了一种高通量、大样本以及快速的分子水平的分析工具。构建胃癌组织芯片进行多基因表达检测具有十分重要的意义，并具有明显优势。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成员，在人类很多恶性肿瘤组织中都可检测出Survivin的表达[4-5]。有研究[9]显示，Survivin参与细胞周期调控，胃癌组织中Suvrivin基因大量表达可能导致凋亡调控机制失常而发生凋亡受阻，这将有助于癌细胞的增殖和转移，提示Survivin可能是一个肿瘤特异性的凋亡抑制因子，很可能成为一个新的肿瘤标记物和肿瘤基因治疗的一个理想的靶基因。在本研究中，Survivin蛋白在胃癌前病变及胃癌中的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织，并且其阳性表达率随着癌变的进展而显著增加。同时，本研究结果也显示，Suvrvini蛋白表达与组织分化程度、浸润程度、淋巴结转移及pTNM分期有关。组织分化程度越低，Survivin蛋白的表达强度越强，有淋巴结转移及临床病理分期越晚，Survivin蛋白阳性表达率越高，提示Survivin蛋白的表达与肿瘤的生物学特性、疾病分期和患者预后有关，Survivin可能是胃癌靶向治疗的一个很好的位点。

抑癌基因p53是迄今发现的与人类多种肿瘤相关性最高的抑癌基因。它包括野生型和突变型两种，其中野生型为肿瘤的抑制基因，突变型为肿瘤的致癌基因，前者的缺失突变或后者的过量表达均可促进肿瘤的发生。p53蛋白的主要生物学功能包括引起细胞周期阻滞、诱导凋亡和促进分化等[10]。本研究组织芯片结果显示，正常胃黏膜p53表达率低，在胃癌前病变和胃癌黏膜组织中均可见p53阳性表达，且随恶性程度增加呈逐渐升高趋势。同时，p53阳性表达与胃癌的临床病理特征关系的研究表明，p53蛋白表达阳性率在胃癌中随组织学分化降低而升高，并且与胃癌浸润相关。在伴淋巴结转移的病例中，p53蛋白表达阳性率显著较高，且随pTNM分期增高而显著增加。表明p53基因突变是胃癌恶性转化的重要事件，其阳性表达与胃癌进展的病理形态学参数存在一定的相关性。

E-cadherin是一种跨膜糖蛋白，具有维持正常上皮完整性和极性的功能，当E-cadherin表达降低或其他因素损害E-cadherin 黏附功能时，肿瘤细胞就易于脱离并逃离原发灶发生侵袭转移[11-12]。因此，E-cadherin的黏附功能丧失是细胞获得低分化和高浸润性的关键。有研究[13]显示，将E-cadherin反义RNA导入高表达E-cadherin 肿瘤细胞株中，可明显提高转移力，提示E-cadherin确有肿瘤转移抑制功能。本研究结果显示，E-cadherin蛋白在正常胃黏膜组织中的阳性表达率为100.00%，而在萎缩性胃炎、不完全性大肠上皮化生、异型增生和胃癌的阳性表达率分别为83.67%、76.47%、63.33%、26.31%，表明E-cadherin下调在胃癌前病变和胃癌发生发展过程中起着重要作用。本研究还发现，在胃癌组织中，分化程度越差、浸润越深，E-cadherin的阳性表达在淋巴结转移患者中明显低于无淋巴结转移患者，提示其与肿瘤的分化、浸润性、转移密切相关。由于以上3种因素均为与患者预后相关的重要因素，因此，E-cadherin也可作为判断肿瘤转移和预后的重要指标。

综上所述，在血吸虫患者胃癌前病变及胃癌组织中，Survivin、p53、E-cadherin蛋白的变化可能与癌变的发生发展、癌细胞的分化、肿瘤的增殖、侵袭及患者的预后有关。

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(责任编辑：钟荣梅)

2014-06-24

国家自然科学基金(81160207)；江西省卫生厅普通科技计划(赣卫科教字【2011】29号)

熊萍香(1962—)，女，学士，副主任医师，主要从事胃肠疾病与消化内镜的研究。

熊江琴，主任医师， E-mail：xiongjiangqin@sina.com。

R532.21

A

1009-8194(2015)03-0015-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2015.03.006