葛根素对2型糖尿病大鼠胃血管病变影响及与胃动力的关系❋

李维辛，周 芸，孙晓玮，王 芳，严 祥

(1.兰州大学第一医院，兰州 730000;2.兰州大学基础医学院，兰州 730000)

葛根素对2型糖尿病大鼠胃血管病变影响及与胃动力的关系❋

李维辛1，周 芸1，孙晓玮2，王 芳1，严 祥1

(1.兰州大学第一医院，兰州 730000;2.兰州大学基础医学院，兰州 730000)

目的:观察葛根素对早期2型糖尿病(T2DM)大鼠胃血管病变的影响及与胃动力的关系。方法:制备T2DM大鼠模型按随机数字表法分为正常对照组(NC组)、葛根素干预正常组(NP组)、糖尿病对照组(DC组)、葛根素干预糖尿病组(DP组)。5周后测定各组胃半排时间(TIME 1/2)、胃排空速率(RATE)、血可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)、胃一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。检测胃内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表达，观察电镜下胃微血管超微结构改变。结果:与NC组比较，DC组血sEPCR、胃MDA升高，胃SOD、NO、eNOS及CD34表达下降，TIME 1/2缩短、RATE加快，胃微血管超微结构受损。而与DC组比较，DP组的这些指标呈相反变化，相关分析显示与TIME 1/2最相关的是eNOS。结论:葛根素可以改善早期2型糖尿病大鼠的胃动力异常、胃微血管损伤以及胃组织氧化应激，胃血管内皮损伤可能是胃动力障碍的始动因素。

葛根素;2型糖尿病;胃动力;胃血管病变;动物模型

研究表明，胃肠道在2型糖尿病的发生发展中具有重要作用，已成为糖尿病治疗的新靶标［1］。糖尿病患者中检出胃肠动力紊乱者可达90%以上，并可累及全胃肠道，其中胃动力障碍最为常见［2］。糖尿病胃动力障碍的确切发病机制尚未阐明。血管病变是糖尿病多种并发症的基础，内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的基础［3］。横断面研究显示，在1型糖尿病病人［4］和2型糖尿病病人［5］中，冠状动脉和外周动脉内皮依赖性的血管舒张是下降的。而胃肠道血管内皮是否也有此相似的改变?胃血管结构和功能的完整性是保障胃血液正常供应的决定因素，而胃的血流又是胃动力的重要保障。因此，本研究探讨中药单体葛根素对早期2型糖尿病大鼠胃血管病变的作用机制以及与胃动力的关系，以期为中药单体临床治疗2型糖尿病胃动力障碍提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量170～200 g，由甘肃省中医学院实验动物中心提供，温度20～25℃，相对湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间10/ 14 h(动物质量合格证编号SCXK(甘)2011-0001-0001346，动物设施使用合格证号SYXK(甘)2011-0001)。

1.2 药物

葛根素购自西安天本生物工程有限公司(批号TBP100430)，经HPLC检测纯度98.5%。

1.3 试剂

链脲佐菌素(STZ)及多聚赖氨酸购自美国Sigma公司，99mTcDTPA购自上海欣科公司;可溶性内皮细胞蛋白 C受体(sEPCR)试剂盒购自美国R＆D公司;CD34一抗购自美国CST公司;eNOS一抗购自美国bioworld公司;SP-9002试剂盒购自美国Zymed公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及双缩脲法总蛋白定量测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器

针孔型探头单光子发射计算机断层照相仪(SPECT，以色列 Elscint Helix)，日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11及 CX21光学显微镜，日本 JEM-1230型投射电镜，美国 Media Cybernetics公司(Image-Pro Plus 6.0)多功能真彩色细胞图像分析管理系统、美国Awareness科技有限公司STAT FAX 2100全自动酶标仪、德国莱卡RM2015切片机。

1.5 方法

1.5.1 模型制作与分组 将大鼠按随机数字表法分为正常饲料组(n=16)和高脂饲料组(n= 20)，分别给予普通饲料和高脂饲料(普通饲料添加10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1%胆酸盐)。喂养8周后，给予高脂组大鼠左下腹腔分2次注射STZ，STZ按1%比例以柠檬酸缓冲液稀释(pH4.4，冰上配制，现配现用)，第1次注射剂量为30 mg/kg，间隔3 d后第2次注射20 mg/kg;正常组大鼠注射相同体积的pH4.4、0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液。于第2次注射后72 h及1周时取尾静脉血，用乐生eB-G型虹吸式血糖仪检测血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L，且伴有明显的多饮、多尿、多食、体质量下降的大鼠，确定为糖尿病造模成功，共16只大鼠成模。将正常及糖尿病模型大鼠分为正常对照组(NC组)、葛根素干预正常组(NP组)、糖尿病对照组(DC组)、葛根素干预糖尿病组(DP组)，随机给各组分配8只进行试验。NP及DP组给予葛根素400 mg/kg，每日1次灌胃(PBS缓冲液配制)，各组灌胃剂量为10 ml/kg·d;NC及DC组每日灌胃等体积的PBS缓冲液。药物干预共5周，每周称体质量1次，根据体质量变化调整给药量。

1.5.2 核素胃排空检查 药物干预结束后，大鼠禁食不禁水16 h，应用含有同位素(99mTcDTPA)标记的半固体食物1 mL(由1 mL纯牛奶与0.5 g面粉配制成糊剂)，通过灌胃器缓慢注入胃内之后立即将大鼠仰卧绑缚于特制固定架上，在SPECT上以大鼠腹部为目标区，窗宽20%，矩阵128×128，放大倍数×3.0，以目标区作为感兴趣区行放射性活性采集，前30 min每5 min采集1次，然后每15 min采集1次，连续测定60 min。通过SPECT自带软件，计算出胃半排时间(TIME 1/2)及排空速率(RATE)的校正值。

1.5.3 血清学指标测定 大鼠完成胃排空检查、乙醚吸入麻醉处死后，心脏采血3～6 mL，普通管3000 r/min离心15 min，取血清-20℃保存，酶法检测血清可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)水平。

1.5.4 胃组织匀浆指标测定 取全胃沿大弯剪开，用冷生理盐水漂洗除去血液滤纸拭干。剪取约1/2的腺胃，加入冷匀浆介质(PH7.4，0.01 mol/ LTris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠溶液)，用匀浆器将标本匀浆化制备成10%的悬液，再在0℃的离心机里以3000 r/ min左右离心20 min。上清液在估计蛋白含量后用来估计丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)等指标。胃组织匀浆总蛋白质含量用双缩脲法测定。MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法，含量用nmol/mg/protein表示;SOD测定采用改良的黄嘌呤氧化酶法，结果以亚硝酸盐单位U/mg/ protein表示;以硝酸还原酶法检测NO含量，结果以umol/L表示。

1.5.5 免疫组织化学方法 检测胃组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表达 取胃窦部组织块(0.5 cm×0.5 cm)置于10%中性缓冲甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋，免疫组织化学染色。包埋后切片、脱蜡，微波修复抗原，滴加兔抗鼠多克隆抗体(一抗最终浓度eNOS-1∶400、CD34-1∶300)及二抗，DAB显色;充分水洗、苏木素复染，用PBS缓冲液分别代替一抗作为阴性对照。高倍镜下观察胃黏膜eNOS及CD34表达情况，应用Image-proplus多媒体图像分析仪测定eNOS阳性表达的平均光密度值(eNOS-OD值)，以及胃黏膜CD34免疫组化阳性染色面积百分比(CD34-%)。

1.5.6 电镜检测胃黏膜微血管超微结构 取胃窦组织块置于3%戊二醛中前固定24 h，1/15M磷酸缓冲液漂洗2次，1%四氧化锇后固定1 h，再经漂洗、梯度脱水。100%丙酮:环氧树脂Epon812浸透、包埋、聚合固化后，切取60～80 nm超薄切片，再经醋酸铀-枸橼酸铅双染色，最后观察拍照分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，非正态数据进行对数转换，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法，计量数据间相关关系采用多因素逐步回归分析，双侧 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠TIME 1/2、RATE变化比较

表1显示，DC组大鼠与NC组比较，TIME 1/2缩短，RATE加快(P＜0.05)。DP组大鼠与DC组比较，TIME 1/2加长，RATE减慢(P＜0.05)。NP组大鼠与NC组各指标比较差异无统计学意义。

2.2 各组大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD的变化比较

表2显示，DC组与NC组比较，胃组织MDA(P＜0.01)含量升高，SOD(P＜0.05)水平下降，NO(P＜0.05)水平下降，血sEPCR浓度增加(P＜0.01)。 DP组与DC组比较，MDA(P＜0.05)浓度降低，SOD (P＜0.01)水平增加，NO(P＜0.05)水平增加，sEPCR浓度减低(P＜0.01)。NP组大鼠与NC组各指标比较差异无统计学意义。

表1 各组大鼠TIME 1/2、RATE变化比较(±s)

表1 各组大鼠TIME 1/2、RATE变化比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05;与DC组比较#P＜0.05

组 别 鼠数 Lg［TIME 1/2］(min) Lg［RATE］(%，min) NC 8 1.66±0.07 0.04±0.07 NP 8 1.76±0.06 -0.06±0.06 DC 8 1.47±0.06* 0.23±0.06*DP 8 1.67±0.07# 0.03±0.07#

表2 各组大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD变化比较(±s)

表2 各组大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD变化比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与DC组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组 别 鼠数 MDA(nmol/ml) SOD(U/mgprot) NO(umol/L) sEPCR(Ug/L) NC 8 2.41±0.10 40.16±1.18 34.66±1.42 117.31±3.12 NP 8 2.40±0.07 39.58±1.50 34.50±1.99 119.71±2.41 DC 8 2.83±0.10＊＊ 36.06±1.51* 30.50±0.77* 129.39±1.93＊＊DP 8 2.49±0.12# 43.50±1.06## 34.74±1.11# 119.74±1.50##

2.3 各组大鼠以CD34标记的胃微血管密度及胃微血管eNOS表达的变化比较

表3显示，DC组大鼠与NC组比较，CD34-%及eNOS-OD下降(P＜0.05);DP组大鼠与DC组比较，CD34-%及 eNOS-OD增加(P＜0.01和 P＜0.05);NP组大鼠与NC组比较差异无统计学意义。

表3 各组大鼠CD34-%、eNOS-OD的变化比较(±s)

表3 各组大鼠CD34-%、eNOS-OD的变化比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05;与DC组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组 别 鼠数 CD34(%)eNOS-OD NC 8 0.30±0.04 0.61±0.07 NP 8 0.37±0.09 0.53±0.04 DC 8 0.20±0.06* 0.36±0.07*DP 8 0.34±0.07## 0.54±0.05#

2.4 各组大鼠胃微血管超微结构的变化

NC组大鼠微血管管腔规则，内皮细胞无肿胀，基底膜为连续完整的电子密度均匀的膜性结构，基底膜结构清楚，环绕内皮细胞。内皮细胞内的异染色质分布均匀，线粒体、内质网及高尔基体等细胞器形态正常。DC组大鼠的微血管管腔变性、狭窄，内皮细胞肿胀，基底膜电子密度不均，连续性及完整性破坏且结构模糊。内皮细胞内异染色质聚集、靠边，线粒体肿胀、嵴变短、消失，部分发生髓鞘样变，甚至结构模糊不清。DP组大鼠的大多数微血管基底膜结构明显，较DC组的清晰并呈连续完整的膜性结构，线粒体无肿胀、扩张，嵴正常，存在双层膜结构，未见异染色质聚集现象。NP组大鼠的微血管电镜下结构正常，同NC组表现(如图1)。

2.5 相关分析

以TIME 1/2为因变量(Y)，以NO(X1)、sEPCR (X2)、MDA(X3)、SOD(X4)、CD34(X5)和eNOS-OD (X6)为自变量进行多因素逐步回归分析，结果显示相关因素为eNOS-OD(F=8.372，P=0.01)，回归方程:Y=0.694 X6+1.268。

图1 各组大鼠胃黏膜层内皮细胞电镜下结构

3 讨论

目前的研究认为，糖尿病多脏器损害的病理基础是大血管和微血管病变，内皮功能障碍被认为是糖尿病血管疾病发病的一个重要因素［3］。NO是主要的内皮源性舒张血管物质，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是其合成的关键酶。内皮细胞蛋白C受体(EPCR)特异性表达于血管内皮细胞的管腔面，参与蛋白 C的抗凝抗炎等途径［6］。病理状态下，EPCR可从血管内皮细胞脱落形成 sEPCR［7］。Brownlee曾指出，高血糖引发的氧化应激对血管内皮细胞损伤是糖尿病并发症发生机制中关键性的第一步［8］。脂类［9］和葡萄糖［10］负荷均与活性氧(ROS)的增加有关。ROS能增加脂质过氧化反应终产物丙二醛(MDA)产生，干扰eNOS的活化，使NO失活，降低血管的舒张反应性［11］，导致血管功能障碍及细胞蛋白、膜脂质和核酸破坏。SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能使 O2-还原成无毒的H2O2。

葛根素(puerarin，Pue)是从野葛 Puerarin Lobata(Willd)Ohwi或甘葛藤P.thomsonii Benth的根中提取的主要有效成分之一，属于异黄酮类化合物，化学名为4，7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮。葛根素的药理作用较多，临床应用也非常广泛，它在心血管疾病中有保护血管等作用［12］。本实验观察到，糖尿病对照组大鼠的胃组织SOD水平下降，MDA含量增高;胃组织eNOS表达以及NO浓度较正常鼠降低，血sEPCR浓度高于正常鼠;胃组织微血管超微结构有损伤，CD34标记的胃微血管面积百分比也较正常鼠明显下降。而葛根素治疗的DP组糖尿病鼠与未治疗的DC组比较，这些改变得到了逆转或改善。说明给早期2型糖尿病大鼠进行葛根素治疗，可以改善大鼠胃组织的氧化应激反应，保护胃血管内皮NO的能力以及减少内皮细胞的破坏脱落，可以预防和改善胃组织微血管超微结构的损伤。其研究也证实，葛根素可提高2型糖尿病大鼠血清抗氧化酶活性，降低脂质过氧化程度［13］。

糖尿病不同病期可出现胃排空加快或减慢，已有的研究结果报道不一。本实验显示，STZ加高糖高脂饲料诱导的糖尿病大鼠，在5周时胃排空速率比较同期的正常鼠是增加的;而同期经葛根素干预的糖尿病大鼠，胃排空速率较糖尿病对照组延迟。研究数据显示，葛根素对正常鼠也有延迟胃排空速率的趋势，但无统计学意义。韩艳梅等研究显示［14］，经单次腹腔大剂量注射STZ联合肌注氢化可的松和利血平制备的糖尿病胃肠病大鼠，每日500 mg/kg葛根素灌胃1次共12周，可明显降低大鼠胃残留率，降低血浆内皮素水平，增加胃窦组织NO含量，认为葛根素具有调整血管内皮细胞分泌功能，预防糖尿病胃肠病变发生的作用。但本实验中葛根素减慢了糖尿病大鼠的胃动力，提示葛根素可能具有双向调节胃运动的功能。

进一步多元逐步回归分析显示，与胃排空最相关的因素是eNOS-OD。前已述及，eNOS是NO合成的关键酶，其活性变化能直接调节NO的生成及其生物学效应。这个结果提示胃血管内皮细胞损伤可能是2型糖尿病大鼠早期胃动力异常的始动因素，改善胃血管结构及功能损害有望纠正糖尿病胃动力异常，进而有助于糖尿病的防治。

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Effect of puerarin on the gastric vessel disease in type 2 diabetic rats and its relationship with gastric motility

LI Wei-xin1，ZHOU Yun1，SUN Xiao-wei2，WANG Fang1，YAN Xiang1(1．First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China; 2．Basic Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

Objective:To investigate the effects of Puerarin on early period gastric vasculopathy in type 2 diabetic (T2DM)rats，and the relationship with gastric motility.Methods:Rat model of T2DM were randomly divided into normal control group(NC)，normal+Puerarin group(NP)，diabetes control group(DC)and diabetes+Puerarin group(DP). Half time of gastric emptying(TIME 1/2)，emptying rate(RATE)，soluble endothelial cell protein C receptor(sEPCR) of serum，Nitric oxide(NO)，malonyldialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，endothelial nitric oxide synthase (eNOS)and CD34 in gastric tissue were measured.Electron microscope stomach microvascular ultrastructure were observed.Results:Compared with NC group，DC rats has higher sEPCR，MDA，and RATE，but SOD，NO，eNOS，CD34 and TIME 1/2 decreased.Stomach microvascular ultrastructure has damaged.Compared with DC group，these substances have opposite appearance.The results of Multivariate stepwise regression analysis showed that eNOS related to TIME 1/2. Conclusion:Puerarin can improve gastric motility disorders，gastric microvascular endothelial injury，and gastric tissue oxidative stress.Gastric vascular endothelial cell injury may be the initiating factor for the gastric motility disorder.

Puerarin;Type 2 diabetes mellitus;Gastric motility;Gastric vasculopathy;Animal models

R587.1

:B

:1006-3250(2015)11-1392-04

2015-03-25

甘肃省自然科学研究基金计划项目(1208RJZA229);甘肃省卫生行业科研计划项目(GSWST09-04)

李维辛(1973-)，甘肃兰州人，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事糖尿病等疾病的临床与实验研究。