建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的探讨❋

唐东昕，郭 斌，罗 莉，龙奉玺，王定雪，李 军，王镜辉，黄 慧，杨 柱△

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.贵阳中医学院，贵阳 550025; 3.刘尚义国医大师传承工作室，贵阳 550001)

建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的探讨❋

唐东昕1，3，郭 斌2，3，罗 莉2，龙奉玺2，王定雪2，李 军2，王镜辉2，3，黄 慧2，杨 柱2，3△

(1.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700;2.贵阳中医学院，贵阳 550025; 3.刘尚义国医大师传承工作室，贵阳 550001)

目的:建立乙醇、HBV双因素诱导的肝癌癌前病变小鼠模型。方法:将32只HBV转基因小鼠，按随机数字表法分为16周对照组和模型组、22周对照组和模型组四组各8只，通过比较小鼠肝重和肝脏指数变化及肝脏病理变化来评价模型的建立情况。结果:模型组肝重和肝脏指数明显增加，肝脏形态学变化显示22周模型组肝损伤最严重，肝细胞层次1～3层增加，肝索排列紊乱，肝细胞不典型增生有小细胞性改变，细胞具有异型性。结论:乙醇、HBV双因素刺激可加重肝损伤，22周时模型组出现肝癌癌前病理变化，肝癌癌前病变动物模型的建立对于进一步探讨肝癌癌前病变的发病机制具有重要意义。

乙醇;HBV转基因小鼠;肝脏指数;肝癌癌前病变;动物模型

近年来，肝癌癌前病变的研究越来越受到重视，其动物模型多采用二乙基亚硝胺(DEN)等化学致癌因素诱发所致，动物模型的合理性决定着后续研究的科学性。根据流行病学提示，饮酒和HBV感染是中国人肝癌发生的两大重要诱因。基于此，本课题组采用乙醇和HBV双因素诱发建立肝癌癌前病变小鼠模型，使其接近于国人肝癌发病特点，这对于探索肝癌癌变过程和阻断机制有着重要的意义。

1 材料

1.1 动物

拷贝高复制HBV转基因雄性小鼠32只，6～8周龄，体质量(23±2)g，购自中国人民解放军第四五八医院全军肝病中心(动物合格证号SCXK(军) 2012-0018)。

1.2 试剂

53%(v/v)红星二锅头白酒，产自北京红星股份有限公司(产品标准号GB/T10781.2);4%多聚甲醛，来自Biotoopped公司。

1.3 仪器

TB-215D型电子天平(美国丹佛公司)，YB-6LF型生物组织石蜡包埋机(湖南亚光公司)，RM2235型组织切片机(德国LEICA公司)，YT-7F型摊烤片机(湖南亚光公司)，BX51型显微镜(日本OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 肝癌癌前病变小鼠模型的制备

32只HBV转基因小鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为16周对照组、16周模型组、22周对照组和22周模型组每组各8只。模型组给予53%(v/v)红星二锅头白酒剂量为10 ml·kg-1灌胃，每天1次;对照组小鼠给予等体积蒸馏水灌胃，每天1次。小鼠自由进食、饮水，每5 d称重1次，根据体质量变化调整灌胃剂量，小鼠分别于第16、22周末取相应组小鼠处死，取肝组织行病理切片，观察肝脏病理变化。

2.2 小鼠一般情况观察

实验过程中观察小鼠的活动情况、精神状态、皮毛光泽度、食欲等。

2.3 小鼠肝重和肝脏指数的影响

于造模第16、22周末各组分别称重后摘除眼球取血，颈椎脱臼处死后立即取小鼠肝脏，盐水冲洗后吸干水分称重，计算小鼠肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量/小鼠体质量(g)×100［1］。

2.4 肝组织形态学影响

于造模第16、22周末取相应小鼠的肝组织，盐水冲洗吸干水分后，放入已准备好的4%多聚甲醛固定液瓶中固定、脱水、包埋、切片、HE染色［2］，在400倍光镜下观察肝组织病理情况。

2.5 评价标准

根据文献制定［3-4］:①显微镜下可见肝细胞不典型增生(小细胞性改变和/或大细胞性改变);②肉眼可见肝组织出现结节性或局灶性改变。出现①和/或②即可判定为肝癌癌前病变。

2.6 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般状况

对照组小鼠灌胃后，精神、呼吸、运动均正常，毛发光泽，对刺激反应灵敏，进食饮水正常并随体质量增加略有增加。模型组小鼠灌胃初期出现精神萎靡、呼吸急促、活动减少、刺激反应减弱、嗜睡、进食饮水减少等情况。从实验开始第4周起，模型组小鼠灌胃后精神萎靡、呼吸急促、嗜睡现象开始减轻，小鼠体质量略有增加，同时发现模型组小鼠打斗比对照组多，从第12周起开始出现有胃肠胀气死亡小鼠，同时观察发现模型组小鼠毛发比空白对照组小鼠毛发稀疏。模型组小鼠从第14周出现眼睛异常明显现象。

3.2 小鼠肝重和肝脏指数的影响

表1显示，与16周对照组比较，16周模型组肝重和肝脏指数明显增加，有统计学意义(P＜0.05);与22周对照组比较，22周模型组肝重和肝脏指数明显增加，有统计学意义(P＜0.05);与16周模型组比较，22周模型组肝重和肝脏指数明显增加，有统计学意义(P＜0.05)，提示乙醇、HBV双因素刺激可加重肝损伤，损伤程度与时间长短成正比。

表1 16周与22周肝重和肝脏指数比较(±s，n=6)

表1 16周与22周肝重和肝脏指数比较(±s，n=6)

注:与对照组比较:△P＜0.05;与16周模型组比较:＊＊P＜0.05

时间/wk 组 别 肝重/g 肝重指数/% 16 对照组1.331±0.026 4.490±0.092模型组 1.457±0.038△ 5.691±0.322△22 对照组 1.370±0.043 4.419±0.140模型组 1.568±0.033△＊＊ 6.236±0.239△＊＊

3.3 肝组织形态学

HE染色400倍光镜下观察对照组小鼠肝小叶结构存在，肝细胞索排列基本整齐，肝细胞水肿明显，细胞大小一致，有轻微的脂肪变性和汇管区，但管周可见少量的炎细胞(见图2A、2C)。16周模型组小鼠部分区域肝细胞层次1～2层增加，肝索排列紊乱，肝细胞水肿明显，肝细胞不典型增生有大细胞性改变，细胞具有异型性，肝细胞核和细胞都增大，核/浆比一般保持正常，核多异型性，常见核深染和多核，可见肝细胞点状坏死，并有部分区域炎性细胞浸润(见图2B)。22周模型组部分区域肝细胞层次1～3层增加，肝索排列紊乱，肝细胞不典型增生有小细胞性改变，细胞具有异型性，肝细胞的细胞体积减小，核/浆比增大，轻度核多形性和核深染，并可见小片状坏死及大量炎细胞浸润(见图2D)。

图2 肝组织病理切片HE染色结果(400×)

3 讨论

大多数学者认为，癌前病变的过程是可逆的，而早发现、早诊断、早治疗是肝癌防治的关键，也是中医“治未病”思想的体现。肝癌癌前病变动物模型的建立，是开展肝癌癌前病变基础研究的重要手段，对于进一步探讨肝癌癌前病变的发病机制具有重要意义。目前，采用化学致癌因素诱发肝癌癌前病变模型的建立最常见的是二乙基亚硝胺(DEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、四氯化碳(CCL4)等。以上方法诱导的肝癌癌前病变模型用肉眼即可观察到肝组织上明显的结节性变化，笔者认为这种变化更接近癌变而非癌前病变。如何选择诱发因素建立更为理想的肝癌癌前病变模型是后期实验研究的关键所在。

全球大约有3.5亿人是乙肝病毒(HBV)的慢性携带者，中国更是HBV感染高发区，约7亿人感染过HBV［5］。流行病学研究已经证实，HBV感染与肝细胞癌(HCC)的发展之间存在着密切相关性［6］。世界卫生组织(WHO)指出:“酒精毒性对肝脏的影响最大，对病毒性肝炎、肝癌等的发生、发展及预后都有重要影响。”如果酗酒的同时又并发肝炎病毒感染，其肝癌发生率可高达50%以上。我们应该认识到，至少25%的乙醇性肝病患者同时并发HBV感染及演变为肝癌的高危性［7］。

中医学无病毒性肝炎及酒精性肝病之类的名称，但中医古代文献对慢性乙型肝炎的临床表现以及长期大量饮酒造成的危害均有所论述，其内容散见于黄疸、胁痛、积聚、鼓胀以及酒风、酒癖、酒劳、酒伤［8］等疾病的论述中。国医大师刘尚义指出:病毒性肝炎和酒精性肝病的病变机理各有特点，但2种病邪皆俱湿热毒性，酒毒伤脾及肝，疫毒损肝犯脾致肝脾同病，气滞、瘀血、痰湿、水饮等病邪裹结形成癌毒，癌毒聚集于肝日久生变，虚实错杂，疾病难愈。2种致病因素相互作用，必然加快疾病的进程，可能导致肝癌的发生。因此，课题组在刘尚义对“治未病”思想的指导下，专门针对HBV感染同时饮酒的肝癌高危人群，建立乙醇性HBV转基因小鼠肝癌癌前病变模型，为肝癌前病变动物模型的建立探索新的方法，为深入研究肝癌发生发展的分子生物学机制奠定基础。

肝脏的质量变化可以客观地反映肝脏病变的情况，在酒精性肝损伤时肝细胞会发生肿大，胞质变性，肝细胞微管受损伤，从而导致分泌功能障碍，分泌性蛋白潴留，肝细胞呈气球样变，严重时肝脂质代谢紊乱，肝细胞内脂肪堆积，肝细胞呈脂肪变性，均可致肝脏肿大、体积增大和质量增加。通过对肝组织病理结果分析发现，对照组HBV转基因小鼠已经具有明显的脂肪变性及炎细胞浸润。国内学者通过酒精对BALB/c小鼠进行16周造模同样观察到肝损伤的情况，但是肝癌癌前病变情况不明显［9］。

本实验用乙醇、HBV双因素加大诱导力度，并在16周的基础上增加22周这个时间点来观察小鼠肝脏损伤的病理改变。通过病理结果可以看出，16周模型组已出现肝细胞层次增加，肝索排列紊乱，偶见有大细胞出现，细胞具有异型性，肝细胞核和细胞增大，核/浆比一般保持正常，核多异型性，常见核深染和多核，可见肝细胞点状坏死，并有部分区域见炎性细胞浸润;22周模型组部分区域肝细胞层次具有1～3层增加，肝细胞不典型增生并有小细胞出现，肝细胞体积减小，核/浆比增大，轻度核多形性和核深染，并可见小片状坏死及大量炎细胞浸润。值得注意的是，22周模型组已出现小细胞性改变。

目前对于肝癌癌前病变的界定尚有争议，没有公认指标。有研究表明［4，10］，在慢性乙型肝炎中大细胞变显示为一个肿瘤相关的病变，认为大细胞变至少提示发生了倾向于肝癌发病的慢性损伤，而小细胞不典型增生比大细胞不典型增生更可能是一种癌前病变。小细胞变的生长速度快于正常肝细胞，与肝癌的发生关系密切，属于癌前病变，而病灶内小细胞性改变主要存在于HBV、HCV慢性感染或酗酒所致的HCC高危慢性肝病中［11-13］。本实验22周乙醇诱导的HBV转基因型小鼠模型组可于镜下见到肝细胞不典型增生，有大细胞性和小细胞性改变，基本符合肝癌前病变模型的判断标准，由此可以推断造模成功。

综上，笔者认为显微镜下肝细胞不典型增生(小细胞性改变和/或大细胞性改变)更符合癌前病变的前瞻性，更有利于肝癌的防治。本实验肉眼未观察到明显的结节及局灶性改变，可能与造模周期、灌酒次数、给酒方式等因素相关，需要进一步证实。

［1］王丽，吕纪华，饶伟源，等.保肝片对大鼠肝纤维化模型的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2013(7):234-236.

［2］俞琦，田维毅，杨柱.葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠细胞因子水平的影响［J］.时珍国医国药，2011(5):1171-1173.

［3］杨拥军.肝细胞性肝癌癌前病变形态学特点及分子生物学研究进展［J］．中国肿瘤，2008(1):41-44.

［4］Bosman F T.消化系统肿瘤WHO分类［M］.4版.崔全才，译.北京:诊断病理学杂社，2012:434-435.

［5］Chinese Society Of Hepatology，Chinese Medical Association Chinese Society of Infectious Diseases.［The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B(2010 version)［J］．Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2011，32(4):405-415.

［6］Tarocchi M S.Polvani，G.Marroncini，A.Galli.Molecular mechanism of hepatitisB virus-induced hepatocarcinogenesis［J］．World J Gastroenterol，2014，20(33):11630-11640.

［7］江正辉，黄志强，董家鸿.亚临床肝癌［M］.北京:军事医学科学出版社，2003:47-50.

［8］杨柱.酒伤病因病机探讨——酒伤专题之二［J］.江苏中医药，2002，23(6):32-33.

［9］苏俊.小鼠酒精性肝纤维化模型的建立及酒精性肝病的临床分析［D］．第一军医大学，2007.

［10］Aaltonen，Stanley R.Hamilton，Lauri A.消化系统肿瘤病理学和遗传学［M］.虞积耀，崔全才，译.北京:人民卫生出版社，2006:204.

［11］杨先照.肝癌前病变中医证候特点及抗纤抑癌方对其HGF和C-Met mRNA调控作用研究［D］.北京:北京中医药大学，2012.

［12］何秀兰，肖俐，刘传波，等.鳖甲煎化裁与局部微创相结合治疗原发性肝癌38例临床观察［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19(4):470.

［13］方肇勤，梁超，任红艳.肝癌常用治法复方抑制肝癌细胞恶性增殖的机制研究［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19(1): 34.

A study on the mouse model of precancerous lesion of liver cancer caused by the Ethanol and HBV factors based on the idea of the prevention disease

TANG Dong-xin1，3，GUO Bin2，3，LUO Li2，LONG Feng-xi2，WANG Ding-xue2，LI Jun2，WANG Jing-hui2，3，HUANG Hui2，YANG Zhu2，3△
(1．China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;3．National Medical Master Liu Shangyi’s Inheritance studio，Guiyang 550001，China)

Objective:Established mouse model of hepatocellular carcinoma precancerous lesions with ethanol and HBV-induced two-factor，provide a better model for liver cancer and precancerous lesions of basic research and experimental treatment.Methods:32 HBV transgenic mice were randomly divided into 16 weeks control group，16 weeks model group，22 weeks control group and 22 weeks model group(n=8)，by comparing the liver weight and liver index changes and pathological changes in the liver to evaluate the model established case.Results:Compared with the control group，model group liver weight and liver index increased significantly;compared with 16 weeks model group，the 22 weeks model group liver weight and liver index increased significantly.Morphological changes in liver Display:22 weeks in the model group is the most serious of liver injury，liver cells increased levels 1～3，hepatic cord disorder，liver cell dysplasia small cell changes，cells atypia.Conclusion:Ethanol，HBV two-factor stimulation can aggravate liver injury，22 weeks HBV transgenic mice model group has liver performance of precancerous lesions.

Ethanol;HBV transgenic mice;Liver index;Hepatocellular carcinoma precancerous;Animal model

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1374-03

2015-02-16

国家自然科学基金资助项目(81160417，81460697);贵州省研究生工作站计划(黔教研合JYSZ字［2014］018);贵州省科学技术厅-贵阳中医学院科学技术联合基金项目(黔科合LH字［2014］7336号)

唐东昕(1977-)，男(土家族)，湖南黔阳人，教授，医学博士，从事中医药防治肿瘤的基础与临床研究。

△通讯作者:杨 柱(1964-)，男，教授，医学博士，从事肿瘤病因病机的基础与临床研究，Tel:0851-85652079，E-mail: yangzhu20150426@163.com。