补肾健脾方药对尾部悬吊大鼠骨组织形态学影响的研究❋

王俊岩，张 林，何信用，陈文娜，孔令东，贾 博

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

补肾健脾方药对尾部悬吊大鼠骨组织形态学影响的研究❋

王俊岩，张 林△，何信用，陈文娜，孔令东，贾 博

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:观察补肾、健脾和补肾健脾三方对尾部悬吊大鼠骨形态计量学的影响。方法:将大鼠按随机数字表法分为正常组、悬吊组、补肾组、健脾组和补肾健脾组5组。除正常组外，其余各组大鼠采用头低位-30°尾部悬吊法模拟失重，连续悬吊21 d。补肾组、健脾组、补肾健脾组每天给予对应方药灌胃，其余各组给予等体积生理盐水灌胃。实验21 d后，ELISA法检测血清骨钙素含量、双能X射线骨密度分析仪检测骨密度、股骨硝酸银染色、胫骨HE染色观察骨组织形态。结果:与正常组比较，悬吊组血清骨钙素、股骨骨密度、股骨骨小梁面积百分率、厚度、数量均明显降低，骨小梁分离度显著增高，胫骨骨小梁明显稀疏;与悬吊组比较，补肾组、健脾组和补肾健脾组各项指标明显改善，且以补肾健脾组改善较为明显。结论:补肾、健脾和补肾健脾三方均对模拟失重引起的骨丢失具有防护作用，能有效改善骨形态计量学参数，以补肾健脾方药作用为优。

补肾健脾;尾部悬吊;模拟失重;骨丢失;骨组织形态计量学

随着航天事业的不断发展，航天员在进入太空后引起的一系列生理适应性反应问题逐渐被人们所关注。在太空环境中，由于失重的原因使作用于人体的重力负荷消失，机体的活动减少，从而导致骨质的丢失，它是航天飞行过程中最常见的病理改变之一［1-3］。现今仍然没有一种有效的办法来解决这一医学问题。中医学认为“肾主骨，脾主四肢”、“脾肾相关”，脾和肾对机体骨量的调节具有重要的作用。据此，本研究通过尾部悬吊大鼠建立失重条件下骨丢失模型，探讨补肾、健脾和补肾健脾方药对模拟失重大鼠股骨形态计量学的作用，为航天失重性骨丢失提供有效防护措施。

1 材料

1.1 动物

SPF/VAF级健康雄性Wistar大鼠50只，体质量(180±10)g，购于北京维通利华实验动物中心(许可证号SCXK(京)2006-0009)。

1.2 药材与试剂

补肾方由鹿茸、淫羊藿等组成，健脾方由生晒参、生黄芪等组成，补肾健脾方由生晒参、生黄芪、鹿茸、淫羊藿等组成，全部药材购自北京同仁堂辽宁有限责任公司(批号1001206020)。全部药材经本校中药教研室老师鉴定均符合国家《药典》标准。方中鹿茸打碎过100目筛兑入药液，3个方中其余药物均采用常规水煎煮法提取，将所得全部药液混合依次浓缩成0.42 g原药材/mL、0.56 g原药材/mL、1g原药材/mL浓度备用。骨钙素ELISA法检测试剂盒，武汉华美生物工程有限公司(批号120915)。

1.3 仪器

美国 Luna r双能 X线骨密度分析仪;德国Leica DMLA显微照相系统;德国Leica硬组织切片机;奥地利Anthos 2010酶标仪。

2 方法

2.1 分组及处理

50只大鼠按随机数字表法分为正常组、悬吊组、补肾组、健脾组和补肾健脾组5组各10只。依据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表计算大鼠给药剂量，补肾组、健脾组、补肾健脾组大鼠从实验第1天开始依次按2.4 g·kg-1·d-1、3.2 g· kg-1·d-1、5.7 g·kg-1·d-1给予补肾方、健脾方和补肾健脾方灌胃，其余各组大鼠灌服等容积的生理盐水。除正常组外其余各组大鼠采用头低位-30°尾部悬吊法［4］模拟失重，每天悬吊24 h共悬吊21d;正常组大鼠不做任何处理。实验第21天各组大鼠称重，于灌胃后2 h后水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，离心留取血清，-20℃冷冻保存。并取双侧股骨和右侧胫骨，-80℃冷冻保存。

2.2 检测指标及方法

2.2.1 血清骨钙素(Osteocalcine，OC)测定ELISA法测定血清骨钙素，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。

2.2.2 股骨骨密度测定 取各组大鼠右侧股骨，除净附着其上的肌肉和软组织，生理盐水冲洗，用双能X射线骨密度分析仪测定大鼠离体右侧股骨的骨密度，骨密度值以单位面积的骨矿物质含量(g·cm-2)表示。

2.2.3 股骨骨形态计量学参数测定 取各大鼠左侧股骨，10%中性甲醛固定，70%～100%酒精梯度脱水，塑料包埋切片，厚度7μm，Von kossa染色。全自动显微镜50倍视野下观察股骨形态并采集图像。取切片中心部的5个视野测量并取其平均数，Image Pro Plus6.0软件测量骨小梁面积比(Tb. Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

2.2.4 胫骨组织形态学观察 取各大鼠右侧胫骨，10%中性甲醛固定流水冲洗，避光下用10% EDTA溶液进行脱钙处理，至骨组织软化后流水冲洗，70%～100%酒精梯度脱水，石蜡包埋切片，厚度5 μm，HE染色，全自动显微镜50倍视野下观察胫骨形态并采集图像。

2.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，所得数据以均数±标准差(±s)表示，单因素方差分析后行组间比较，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 补肾、健脾、补肾健脾三方对尾部悬吊模型大鼠血清骨钙素含量的影响

表1显示，与正常组比较，悬吊组大鼠血清骨钙素含量明显降低(P＜0.01);与悬吊组比较，补肾组、健脾组、补肾健脾组大鼠血清骨钙素含量明显升高(P＜0.01);与补肾健脾组比较，健脾组大鼠血清骨钙素含量降低(P＜0.05)。

3.2 补肾、健脾、补肾健脾三方对尾部悬吊模型大鼠股骨骨密度的影响

表1显示，与正常组比较，悬吊组大鼠股骨骨密度明显降低(P＜0.01);与悬吊组比较，补肾组和补肾健脾组大鼠股骨骨密度明显升高(P＜0.01)，健脾组大鼠股骨骨密度升高(P＜0.05);与补肾健脾组比较，补肾组大鼠股骨骨密度降低(P＜0.05)，健脾组大鼠股骨骨密度明显降低(P＜0.01)。

表1 补肾、健脾、补肾健脾三方对尾部悬吊大鼠血清骨钙素含量和股骨骨密度的影响(±s，n=10)

表1 补肾、健脾、补肾健脾三方对尾部悬吊大鼠血清骨钙素含量和股骨骨密度的影响(±s，n=10)

注:与正常组比较:2)P＜0.01;与悬吊组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与补肾健脾组比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01

组别 骨密度(g·cm-1) 骨钙素(μg·L-1)正 常 组0.130±0.004 6.534±0.250悬 吊 组 0.103±0.0032) 3.858±0.1482)补 肾 组 0.117±0.0064)5) 5.209±0.2334)健 脾 组 0.111±0.0033)6) 4.853±0.0864)5)补肾健脾组 0.122±0.0064) 5.841±0.1314)

3.3 补肾、健脾、补肾健脾三方对尾部悬吊大鼠股骨骨形态计量学参数的影响

图1表2显示，与正常组比较，悬吊组大鼠股骨Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均显著降低(P＜0.01)，Tb.Sp显著升高(P＜0.01);与悬吊组比较，补肾组和补肾健脾组大鼠股骨Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N显著升高(P＜0.01)，Tb.Sp明显降低(P＜0.01);健脾组大鼠股骨Tb.Ar和Tb.Th显著升高(P＜0.01)，Tb.N升高(P＜0.05)，Tb.Sp降低(P＜0.05);与补肾组健脾组比较，补肾组大鼠股骨Tb.Ar和Tb.Th下降(P＜0.05)，Tb.Sp升高(P＜0.05);健脾组大鼠股骨Tb.Ar(P＜0.05)下降，Tb.Th明显下降(P＜ 0.01)，Tb.Sp升高(P＜0.05)。

表2 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠股骨骨形态计量学参数的影响(±s，n=5)

表2 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠股骨骨形态计量学参数的影响(±s，n=5)

注:与正常组比较:2)P＜0.01;与悬吊组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与补肾健脾组比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01

组别Tb.Ar(%) Tb.Th(μm) Tb.N(mm) Tb.Sp(μm)正 常 组 31.28±2.09 76.66±4.33 4.18±0.28 211.41± 9.08悬 吊 组 15.22±0.782) 52.49±2.892) 2.82±0.272) 267.09± 8.072)补 肾 组 23.61±3.314)5) 65.61±4.064)5) 3.59±0.404) 238.31± 9.224)5)健 脾 组 22.62±1.454)5) 63.92±2.944)6) 3.32±0.333) 248.11±98.443)5)补 肾健脾 组 27.35±2.344) 70.43±2.114) 3.88±0.234) 226.37± 7.304)

图1 各组大鼠股骨von kossa染色

图2 各组大鼠胫骨HE染色

3.4 补肾、健脾、补肾健脾三方对模拟失重大鼠胫骨组织形态学的影响

图2显示，各组大鼠胫骨HE染色可见，正常组大鼠骨小梁形态结构清晰完整，排列致密有序;与正常组比较，悬吊组大鼠骨小梁断裂，数量明显减少，排列稀疏;与悬吊组比较，补肾组和健脾组大鼠骨小梁结构改善，数量明显增加、排列有序，补肾健脾组大鼠骨小梁结构明显改善，排列有序成网状。

4 讨论

研究表明，人类在进入太空后失重环境会导致骨质丢失，骨质丢失一般发生在腰椎、股骨、胫骨、盆骨等特定部位。航天失重所造成的骨质丢失严重影响了航天作业和航天员返回地面的适应能力，必须采取有效的措施来解决这一问题［5］。中医学认为，“肾藏精，主骨生髓”、“脾主运化，主四肢，在体合肌肉”、“肾为先天之本，脾为后天之本”，骨的生长、发育和衰弱等都与肾精的盛衰和脾气的充盛有密切关系。已有学者研究表明，补肾中药对失重性骨丢失具有明显的改善作用［6］。本研究采用目前国内外公认的大鼠尾部悬吊模型模拟失重［4］，依据中医对失重性骨丢失的病机认识选用补肾健脾方药进行防治，观察该方中补肾中药、健脾中药以及全方对尾部悬吊大鼠股骨和胫骨骨形态学的影响，以期获得防治失重性骨丢失的有效方药。

血清骨钙素由成骨细胞产生和分泌，能直接反映骨的形成状况，具有骨代谢调节激素的作用，其合成受1.25(OH)2D3调节，当发生失重性骨质疏松时，破骨细胞功能增强，成骨细胞功能减弱，1.25 (OH)2D3合成下降，OC合成低下［7-8］。失重性骨丢失是以骨形成减少为主导的骨质疏松，中长期载人航天数据表明，航天员在太空飞行180 d过程中，确实出现了血清骨钙素水平降低的现象［9］。本研究结果发现，悬吊组大鼠血清骨钙素含量较正常组显著下降，表明尾部悬吊21 d大鼠骨形成减少，与以往其他研究小组的研究结果一致［10］。补肾方药、健脾方药和补肾健脾方药均能显著升高大鼠血清骨钙素含量，说明3个方剂对失重性骨丢失大鼠骨更新率有明显的改善作用，且补肾健脾方药作用明显。

当发生骨质疏松时骨密度降低，骨组织形态学发生相应改变，其中骨小梁面积百分率、骨小梁厚度、骨小梁数量降低，骨小梁分离度增高，骨组织形态变得稀疏无规律［11］。本研究结果发现，悬吊组大鼠股骨骨密度降低，股骨骨形态计量学参数变化以及胫骨HE染色结果均表明，尾部悬吊21 d大鼠发生了骨质疏松。补肾方药、健脾方药、补肾健脾方药可明显升高股骨骨密度、骨小梁面积百分率、骨小梁厚度和骨小梁数量，显著降低骨小梁分离度。本课题组之前的研究也表明［12］，3个方剂可以升高胫骨骨密度，提示对于尾部悬吊模拟失重导致的胫骨和股骨骨丢失，3个方剂均有不同程度的作用，而以补肾健脾方药作用最优，但其具体调节骨代谢的作用机制，如对甲状旁腺素、降钙素和1.25(OH)2D3影响还有待于进一步探讨。

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Effects of Tonifying Kidney and Invigorating Spleen Prescription on the Bone Histomorphometry in Rat Tail Suspension Model

WANG Jun-yan，ZHANG Lin△，HE Xin-yong，CHEN Wen-na，KONG Ling-dong，JIA Bo
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

Objective:To investigate the effect of tonifying kidney prescription，invigorating spleen and tonifying kidney and invigorating spleen prescription on the bone histomorphometry of tail-suspended rat.Methods:50 male Wistar rats were randomly divided into five groups:the normal group，the suspension group，the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group.Except the normal group rats，The remaining rats were suspended by head down tilt-30°for 21 days.Rats in the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group were orally administrated with three decoctions and other groups with equivalent saline.Experiment 21 days，Osteocalcine was detected by ELISA method;Bone mineral density was measured using dual energy X ray absorptiometry，Through Silver nitrate staining of femur，HE staining of Tibial bone to observe the morphology of Bone tissue.Result:Compared with the normal group，The suspension group serum osteocalcin was significantly lower，femur bone mineral density was significantly lower，the trabecular bone area，trabecular thickness and trabecular number of femur bone were significantly lower，Trabecular separation significantly higher，trabecular obviously sparse of Tibial bone;Compared with the suspension group，the indexes of the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group has improved significantly，and the tonifying kidney and invigorating spleen group improved obviously.Conclusion:Tonifying kidney prescription，invigorating spleen and tonifying kidney and invigorating spleen have protective effect on the simulated weightlessness induced bone loss，can effectively improve the bone histomorphometry parameters，and the effecs of the tonifying kidney and invigorating spleen prescrpition was obvious.

Tonifying kidney and invigorating spleen;Tail-suspended;Simulated weightlessness;Bone loss;Bone histomorphomet

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1404-03

2015-03-23

国家自然科学基金资助项目(81001493);教育部博士点新教师基金(20102133120001);辽宁中医药大学大学生创新创业训练计划项目(201310162057);辽宁省高等学校杰出学者成长计划项目(LT2014103)

王俊岩(1992-)，男，辽宁营口人，在读硕士，从事中医药的临床与研究。

△通讯作者:张 林(1977-)，女，河北吴桥人，副教授，硕士研究生导师，从事方剂效用机理与配伍规律研究，Tel:024-31207085，E-mail:zhanglin770622@hotmail.com。