丹蛭降糖胶囊对高脂饲养大鼠骨骼肌脂联素蛋白构成的影响❋

陈 燕，陈明卫△，方朝晖，夏同佳，童俊露，王佑民

(1.安徽医科大学第一附属医院内分泌科，合肥 230032; 2.安徽中医药大学第一附属医院内分泌科，合肥 230031)

丹蛭降糖胶囊对高脂饲养大鼠骨骼肌脂联素蛋白构成的影响❋

陈 燕1，陈明卫1△，方朝晖2，夏同佳1，童俊露1，王佑民1

(1.安徽医科大学第一附属医院内分泌科，合肥 230032; 2.安徽中医药大学第一附属医院内分泌科，合肥 230031)

目的:观察丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠骨骼肌脂联素(APN)蛋白多聚体构成的影响。方法:SD大鼠随机分为普通对照组(NC组)、高脂对照组(HF组)、低剂量丹蛭降糖胶囊组(FD1组)和高剂量丹蛭降糖胶囊组(FD2组)。检测血清总APN、高分子量APN(HMW APN)以及骨骼肌组织中各聚合态APN蛋白表达。结果:HF组大鼠血清以及骨骼肌HMW APN均低于NC组，FD1组、FD2组大鼠骨骼肌HMW APN表达高于HF组，FD2组大鼠骨骼肌HMW APN表达显著高于FD1组。结论:丹蛭降糖胶囊能提高骨骼肌中HMW APN蛋白水平，具有剂量依赖效应。

肥胖;骨骼肌;脂联素;大鼠;丹蛭降糖胶囊

脂联素(APN)是脂肪组织分泌性蛋白，与肥胖密切相关［1］。近年来研究表明，APN也可在骨骼肌组织中表达分泌。这种骨骼肌源性APN同样具有调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗(IR)、促进脂肪酸氧化的效应［2-3］。丹蛭降糖胶囊是由太子参、丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭组成的复方制剂。研究发现，它可提高肥胖模型大鼠骨骼肌IR，具体机制目前尚不完全清楚［4-5］。本研究通过高脂喂饲建立肥胖大鼠模型，使用丹蛭降糖胶囊进行干预，观察骨骼肌组织中APN蛋白多聚体构成的变化，初步探讨丹蛭降糖胶囊改善骨骼肌IR的机制。

1 材料与方法

1.1 饲养及分组

清洁级4周龄70只雄性SD大鼠，体质量(150 ±30)g，购自安立实验动物公司(动物合格证号4322)。适应性喂养1周后，随机挑选15只大鼠作为普通饮食对照组(NC组)，给予普通饲料喂养，其余55只给予高脂饲料喂养，作为高脂饮食组(HD组)。12周后以HD组大鼠体质量超过NC组大鼠平均体质量20%为标准来确定肥胖大鼠造模成功。45只符合肥胖模型的大鼠按体质量再随机分为高脂对照组(HF组)、高脂+低剂量丹蛭降糖胶囊组(FD1组)、高脂+高剂量丹蛭降糖胶囊组(FD2组)各15只，继续高脂饮食，同时每组分别给予溶媒2 ml ·kg-1·d-1、丹蛭降糖胶囊470 mg·kg-1·d-1、丹蛭降糖胶囊940 mg·kg-1·d-1灌胃。NC组继续普通饲料喂养，给予蒸馏水灌胃，持续治疗时间4周。

1.2 主要仪器和试剂

MODULE P800型全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司)、水平电泳槽、兔抗鼠APN单克隆一抗(美国Millipore公司，克隆号为AD1773，Uniprot编号为Q15848，Entrez基因编号为NM_004797.2)、山羊抗兔多克隆二抗(江苏碧云天生物科技公司，批号A0562)、蛋白提取试剂盒(上海申能博彩生物技术公司)、BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术公司)、PDVF膜(苏州广惠科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本收集 16周时4组大鼠禁食过夜8h后，以10%水合氯醛麻醉，麻醉状态下准确称取体质量，下腔静脉取血分离血清，-80℃冰箱中以备各项生化指标的测定;迅速分离大鼠股四头肌组织，置于液氮罐中保存以备提取TG。

1.3.2 血液生化指标检测 强生稳步倍加型血糖仪及配套试纸检测空腹血糖(FBG)，全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)，放射免疫法检测空腹血清胰岛素(FINS，美国Linco公司)，铜显色法测定血游离脂肪酸(FFA，江苏南京建成生物公司)。

1.3.3 大鼠血清APN测定 4组大鼠禁食过夜8 h后，以10%水合氯醛麻醉下腔静脉取血、分离血清。采用大鼠血清APN双抗体夹心法ELISA试剂盒(美国R＆D公司)测定血总APN、高分子量脂联素(HMW APN)以及低分子量脂联素(LMW APN)。主要步骤:设置标准品孔和样本孔，其中标准品孔加入标准品50 μl，样本孔加待测样本10 μl，再加入稀释液40 μl。随后标准品孔中和样本孔中每孔加入辣根过氧化酶标记的检测抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，恒温箱温育60 min后应用洗板机洗板干燥。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min，每孔加入终止液50 μl，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，按曲线方程计算各样本总APN、HMW APN以及LMW APN浓度值(μg/ml)。并根据ELISA法测得结果计算血清中HMW比例=血HMW APN(μg/ ml)/血总APN(μg/ml)。

1.3.4 大鼠骨骼肌组织APN蛋白测定 取100 mg股四头肌组织剪碎，加入1 ml组织裂解液置于冰上，玻璃匀浆器匀浆，4℃ 12000 rpm×10 min离心，按BCA法测定蛋白浓度。取骨骼肌组织蛋白与非还原非变性加样缓冲液(江苏碧云天生物科技公司)混匀于4℃进行8%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭。加入兔抗鼠APN一抗(1∶300)孵育过夜。第2天加入山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体(二抗试剂，1∶5000)孵育2 h，ECL显影，使用Band Scan 5.0软件分析条带灰度，骨骼肌中各聚合态APN蛋白表达水平以各聚合态APN/GAPDH灰度值表示。骨骼肌中HMW比例=HMW/(HMW+LMW)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行t检验，数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量、代谢指标变化

表1显示，HF组的体质量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均高于NC组(P＜0.05～0.01)。FD1组、FD2组体质量、FBG、FINS、TG、TC、FFA均较HF组有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各组大鼠血清总APN、HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比较

表2显示，与NC组比较，HF组大鼠血清总APN、HMW APN水平以及HMW比例均明显降低(P＜0.05);HF组、FD1组、FD2组3组间大鼠血清总APN、HMW APN水平以及HMW比例均无显著变化(P＞0.05)，4组间LMW APN水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠体质量、代谢指标的比较(±s)

表1 各组大鼠体质量、代谢指标的比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 鼠数 体质量(g) FBG(mmol/L) FINS(mIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(μmol/L) NC组 15 353.36±42.26 5.11±0.87 11.96±4.16 0.47±0.74 1.43±0.31 327.24±38.31 HF组 15 460.48±53.58＊＊ 6.75±1.99＊＊ 35.12±12.27＊＊ 0.98±0.62＊＊ 1.88±0.34* 475.42±40.18＊＊FD1组 15 457.22±48.91 6.52±1.66 27.96±11.08 0.93±0.69 1.79±0.31 457.83±40.28 FD2组 15 450.13±49.31 6.37±1.71 25.17±10.04 0.90±0.68 1.76±0.32 447.65±43.82

图1 Western blot检测大鼠骨骼肌APN多聚体构成

2.3 各组大鼠骨骼肌组织HMW APN、LMW APN水平以及HMW比例的比较

表3显示，非还原非加热变性的SDS-PAGE检测到3条APN蛋白条带，～130 kDa条带代表相对低分子量六聚体LMW APN，～250 kDa和＞300 kDa条带代表高分子量高聚体HMW APN(图1)。与NC组比较，HF组大鼠骨骼肌HMW APN表达以及HMW比例均明显降低(P＜0.05～0.01);与HF组比较，FD1组、FD2组大鼠骨骼肌HMW APN表达以及HMW比例均显著增加(P＜0.05);与FD1组比较，FD2组大鼠骨骼肌HMW APN表达以及HMW比例均显著增加(P＜0.05)，4组间LMW APN水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠血清APN水平的比较(±s)

表2 各组大鼠血清APN水平的比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05

组 别 鼠数 总APN (μg/ml) HMW APN (μg/ml) LMW APN (μg/ml) HMW/总APN NC组15 4.01±0.13 2.03±0.15 0.73±0.12 0.50±0.06 HF组 15 1.98±0.14* 0.88±0.16* 0.75±0.10 0.44±0.05*FD1组 15 2.15±0.14 1.06±0.18 0.73±0.11 0.46±0.07 FD2组15 2.18±0.15 1.12±0.18 0.73±0.13 0.48±0.06

表3 各组大鼠骨骼肌组织APN蛋白表达比较(±s)

表3 各组大鼠骨骼肌组织APN蛋白表达比较(±s)

注:与NC组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与 HF组比较:△P＜0.05;与FD1组比较:☆P＜0.05

APN 组 别 鼠数 HMW APN LMW APN HMW/总NC组15 1.19±0.14 0.69±0.12 0.69±0.06 HF组 15 0.66±0.15＊＊ 0.62±0.11 0.45±0.05*FD1组 15 0.89±0.14△ 0.63±0.12 0.54±0.06△FD2组 15 1.03±0.13△☆ 0.64±0.13 0.63±0.07△☆

3 讨论

目前已证实，APN具有减轻IR、抗动脉粥样硬化和抗炎作用，其部分生物活性依赖于其自身的多聚体化过程。APN可以通过3个球形结构域将单体连接成三聚体，2～6个三聚体通过胶原结构域进一步连接成LMW APN或者HMW APN的高级结构。血浆中APN以多种聚合态存在，主要为低聚态和高聚态。研究表明，HMW APN是APN作用的主要活性形式，对改善胰岛素敏感性更重要。有研究发现，基因部分位点突变会影响APN合成分泌多聚化过程，从而影响HMW APN含量及其比例，导致APN生物活性受损［6］。

高脂诱导的SD肥胖大鼠与人类肥胖的发生过程和表现非常相似，是较理想的营养性肥胖研究模型。本研究发现，与普通饮食组大鼠比较，高脂对照组肥胖大鼠的内脏脂肪明显增加，糖脂代谢紊乱更加明显，IR程度加重，同时血清总APN、HMW APN、HMW比例均有一定程度下降，整体上呈抑制状态，与先前的研究发现一致［7-8］。有研究已证实，高脂高热卡诱导的肥胖可对皮下以及内脏脂肪组织中APN多聚化过程造成影响［6］，但是否会影响骨骼肌中APN多聚化过程尚不清楚。本研究发现，与普通饮食对照组大鼠比较，高脂对照组大鼠骨骼肌中HMW APN表达以及HMW比例均显著降低，表明高脂诱导的肥胖可对骨骼肌组织中APN多聚化过程造成影响，从而参与骨骼肌IR的发生发展。

丹蛭降糖胶囊是由太子参、丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭组成的复方制剂，已于2006年获得国家发明专利授权［9］。研究表明，它具有改善糖脂代谢以及IR等功效［4，10］，但其具体机制尚不明确。有研究报道，丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病IR大鼠血浆APN水平的改变具有剂量依赖效应，丹蛭降糖胶囊高剂量组较低剂量组升高血浆APN水平更高［11］。故本研究选择高、低剂量组的丹蛭降糖胶囊进行干预。结果发现，无论低剂量组(FD1组)还是高剂量组(FD2组)，应用丹蛭降糖胶囊干预后，肥胖大鼠血总APN及HMW比例无显著影响，与先前在2型糖尿病肥胖大鼠中的发现不一致［11］，原因尚不清楚，推测可能与2组研究中实验大鼠肥胖程度、糖脂代谢紊乱程度等因素差异有关。另一方面，本研究发现，无论是FD1组还是 FD2组，大鼠骨骼肌中HMW APN与HMW比例均有显著提高，表明在肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌水平会受丹蛭降糖胶囊影响而上调，提示丹蛭降糖胶囊可能通过影响肥胖大鼠骨骼肌中APN多聚化过程，从而改善骨骼肌IR。进一步分析还发现，高剂量组中大鼠骨骼肌中HMW APN表达以及HMW比例的提高均显著高于低剂量组，表明丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠骨骼肌APN多聚化的改变具有剂量依赖效应。本研究结果将为揭示丹蛭降糖胶囊改善骨骼肌IR提供一个新的机制认识。

总之，本研究发现丹蛭降糖胶囊可促进肥胖大鼠骨骼肌中HMW APN的合成分泌，提高HMW比例，这种效应具有剂量依赖效应。

［1］Okamoto Y，Kihara S，Funahashi T，et al.Adiponectin:a key Adipocytokine in metabolic syndrome［J］.Clin Sci(Lond)，2006，110(3):267-278.

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［4］方朝晖，鲍陶陶，王开成，等.丹蛭降糖胶囊对糖尿病胰岛素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖转运体IV基因表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(6):32-35.

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［9］方朝晖.丹蛭降糖胶囊及其制备方法:中国，200310112845.1［P］.2006-07-19.

［10］方朝晖，王佑民，王开成，等.丹蛭降糖胶囊对胰岛素抵抗大鼠PPAR-γ mRNA表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(4):36-39.

［11］方朝晖，张静波，王开成，等.丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠脂联素的影响［J］.中医药临床杂志，2008，20 (6):613-615.

Effects of Danzhi Jiangtang Capsule on Adiponectin Composition in Skeletal Muscle in Obese Rats Fed with High-fat Diet

CHEN Yan1，CHEN Ming-wei1△，FANG Zhao-hui2，XIA Tong-jia1，TONG Jun-lu1，WANG You-min1
(1．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2．Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM，Hefei 230031，China)

Objective:To investigate the effect of Danzhi Jiangtang Capsule on adiponectin compostion in skeletal muscle in high-fat diet(HFD)SD rats.Methods:Rats were randomly divided into 4 groups(n=15):chow diet rats as NC group，HFD rats treated with vehicle，low-dose Danzhi Jiangtang Capsule(470 mg·kg-1·d-1)and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule(940 mg·kg-1·d-1)as HF，FD1 group and FD2 group，respectively.Serum total adiponectin and high molecular weight adiponectin were detected by ELISA，respectively.Adiponectin oligomer compostion in skeletal muscle were separated by Western blot under non-heat-denatured and non-reduced conditions.Results:In HF group，either in serum or in skeletal muscle，high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin were all significantly reduced as compared with NC group.Compared with HF group，both low-dose Danzhi Jiangtang Capsule and high-dose Danzhi Jiangtang Capsule showed a significant increase of high molecular weight adiponectin，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle.Moreover，high molecular weight adiponectin expression，and the ratio of high molecular weight adiponectin to total adiponectin in skeletal muscle in FD2 group were significantly higher than those in FD1 group.Conclusions:Danzhi Jiangtang Capsule could enhance high molecular weight adiponectin level in skeletal muscle in a dose-independent manner.

Obese;Skeletal muscle;Adiponectin;Rats;Danzhi Jiangtang

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1447-03

2015-04-07

国家中医临床研究基地专项课题(JDZX2012005)-肌源性脂联素在高脂诱导的骨骼肌胰岛素抵抗中的作用以及丹蛭降糖胶囊的干预研究

陈 燕(1987-)，女，安徽芜湖人，主治医师，在读硕士，从事肥胖发病机制的临床与研究。

△通讯作者:陈明卫(1968-)，男，安徽肥东人，主任医师，从事肥胖发病机制的临床与研究，Tel:0551-62922069。