营养干预对阿尔茨海默病转基因小鼠脑内IDE和NEP水平的影响

何颖 崔宇 孙晓红 王超 党瑞 吴群红 王德才

营养干预对阿尔茨海默病转基因小鼠脑内IDE和NEP水平的影响

何颖 崔宇 孙晓红 王超 党瑞 吴群红 王德才

目的 采用复合营养素对阿尔茨海默病（AD）APP⁃PSN双转基因小鼠营养干预，观察脑内胰岛素降解酶（IDE）和脑啡肽酶（NEP）水平的差异，探讨营养干预对AD预防和缓解的作用机制。 方法 将72只2月龄APP⁃PSN双转基因小鼠，随机分为干预组和模型组，干预组又分高、低2个剂量组；24只APP⁃PSN转基因阴性小鼠作为阴性对照组。干预组饲喂添加复合营养素的饲料，模型组和阴性对照组饲喂基础饲料。在干预7月后，免疫组织化学法染色观察小鼠脑组织中老年斑沉积；采用酶联免疫吸附试验方法检测各组小鼠脑组织内IDE和NEP水平。 结果 模型组小鼠大脑皮层及海马区有较多β淀粉样淡黄色斑块沉积（＋＋＋）；高、低干预组分布较少（＋）；阴性对照组无沉积（－）。小鼠脑内IDE和NEP水平，高、低干预组与模型组均有统计学差异（P＜0.05）。

结论 复合营养素干预能够提高APP⁃PSN双转基因小鼠脑内IDE及NEP的活性及含量，减少β淀粉样蛋白沉积，有改善AD病情，预防AD的作用。

阿尔茨海默病；胰岛素降解酶；脑啡肽酶；β淀粉样蛋白

阿尔茨海默病（AD）是一种发病率较高，以认知功能减退为特征的神经退行性改变的老年性疾病，发病机制未明，迄今为止尚无药物能够有效治疗AD［1］。近年来研究认为脑内β淀粉样蛋白（Aβ）沉积是AD的主要病理学特征之一［2⁃3］，因此，控制Aβ蛋白的沉积，促进其降解可能预防AD的发生。目前有研究表明，脑内脑啡肽酶（NEP）和胰岛素降解酶（IDE）能够降解或减慢Aβ的产生及沉积［4⁃5］，IDE和NEP水平降低会加剧脑内Aβ聚集，水平升高则能降低脑内Aβ水平［6］。本研究主要通过对C57BL／6JAPP⁃PSN转基因小鼠进行复合营养素干预，观察营养素对小鼠脑内IDE和NEP水平影响，探讨复合营养素在AD预防和缓解中的作用机制，为AD早期营养干预提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及基础饲料 动物：2月龄C57BL／6JAPP⁃PSN转基因鼠72只，雌雄各半（南京大学模式动物研究所提供），许可证号：SCXK（苏）2010⁃0001。基础饲料：玉米淀粉，麦芽糖糊精，粉状纤维素，酪蛋白，蔗糖，豆油，L⁃半胱氨酸（北京奥博星生物科技有限责任公司）。

1.2 仪器及试剂 仪器：SUNRISE酶标仪（Unters⁃bergstr，奥地利），OLYMPUS显微镜（日本）。试剂：小鼠胰岛素降解酶ELISA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠脑啡肽ELISA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠Aβ1⁃42抗体（香港，Abcam公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01 mol／L；Tris缓冲液（TBS）：0.05 mol／L Tris⁃HCL。营养素：维生素E，维生素B6，维生素B12，叶黄素，叶酸，磷脂酰丝氨酸，锌，硒，二十二碳六烯酸（DHA），二十碳五烯酸（EPA，北京奥博星生物科技有限责任公司），蓝莓花青素（大兴安岭林格贝有机食品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组：小鼠适应性喂养1周后，将APP⁃PSN双转基因小鼠按体质量随机分为干预组和模型组，其中高干预组（HG）、低干预组（LG）各24只，模型组（MG）24只，雌雄各半；阴性对照组（NG）为同窝转基因阴性鼠24只。高干预组、低干预组、模型组和阴性对照组小鼠体质量和出生日期无统计学差异。干预组饲喂自制添加复合营养素的饲料，模型组和阴性对照组饲喂符合美国AIN⁃93标准的基础饲料。动物在SPF级动物房内单笼饲养，室内温度20℃～22℃，照明明暗各12 h，每周固定时间称重，自由饮食和饮水。

1.3.2 营养素选择及干预：以中国居民膳食营养素参考摄入量为基础，结合人群和动物营养干预相关的各类权威资料数据分析，制定复合营养素干预配方。选择2种微量元素（锌、硒），4种维生素（维生素B6、维生素B12、维生素E、叶酸），另外选择叶黄素、DHA＋EPA、磷脂酰丝氨酸、蓝莓花青素等10种营养素，并添加至基础饲料，自制成复合营养干预饲料。干预方法：每日先给予干预饲料，再根据小鼠食量的补充添加基础饲料。高、低干预组根据体质量计算干预剂量，每周一称量试验小鼠体质量，推算出干预饲料每日饲喂量。因小鼠每天饲料摄入量较小，故干预剂量1周为1个周期计算。模型组和阴性对照组饲喂基础饲料。

干预7月后对4组实验小鼠进行低温处死，无菌条件下以矢状缝为界一半脑组织投入4%多聚甲醛溶液中固定48 h后行蜡块包埋及切片，另一半投入液氮后迅速保存于－80℃冰箱待行NEP和IDE水平分析。

1.3.3 免疫组化染色：脑组织石蜡病理切片采用HE（苏木精⁃伊红，Hematoxylin⁃Eosin）染色。用兔抗鼠抗Aβ1⁃42为第一抗体进行免疫组织化学法，对小鼠脑组织老年斑沉积作定位染色分析。首先在68℃烤片过夜，经二甲苯脱蜡，依次用95%、90%、85%、80%浓度的乙醇水化；双重蒸馏水漂洗2次，再用0.01 mol／L PBS缓冲溶液漂洗，3%过氧化氢处理10 min，除去组织中的过氧化氢酶；将切片置于柠檬酸抗原修复液中修复，2100℃高压4 min；冷却至室温；用双蒸水冲洗2次，0.01 mol／L PBS冲洗3次，加入山羊血清封闭，10 min后甩去多余血清，滴加Aβ抗体，4℃孵育过夜；次日取出用0.01 mol／L PBS漂洗3次，加入生物素⁃山羊抗小鼠IgG室温孵育20 min；用0.05 mol／L Tris⁃HCL漂洗后，滴加链霉素抗生物素蛋白⁃过氧化氢酶室温孵育20 min，用0.01 mol／L PBS充分漂洗3次；对照组及阴性对照组用0.01 mol／L PBS溶液代替一抗，排除二抗的非特异性染色。镜下控制DAB显色，约30 s，用蒸馏水冲洗2 min，终止反应；苏木素20 s复染，依次用80%、85%、90%乙醇脱水，蒸馏水冲洗至无色透明，中性树胶封片。光学电子倒置显微镜观察，采集图像。

1.3.4 脑组织IDE和NEP检测：样品处理：将－80℃冰箱保存的小鼠脑组织取出暂解冻，按质量体积比1∶5加入0.9%的生理盐水置组织匀浆器中匀浆，3000 r／min离心10 min后取上清备测。按IDE和NEP固相夹心法酶联免疫吸附试验试剂盒使用说明书进行测定。

1.4 统计学处理 应用统计软件SPSS 17.0处理所有数据。所有计量资料均用¯x±s表示；采用单因素方差分析进行统计分析，组间两两比较采用LSD法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 在整个动物实验过程中，高、低干预组与对照组小鼠均无死亡，毛色、进食、精神状况、活动能力等方面均未见异常。实验过程中干预组、模型组和阴性对照组小鼠摄食量和体质量增加在各组、各时间点上比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 4组小鼠各月龄平均体质量比较（¯x±s，g，n＝24）

2.2 脑组织中IDE和NEP水平 采用固相夹心酶联免疫吸附试验方法，对各组小鼠脑组织中IDE和NEP含量检测。方法的质量控制标准曲线方程、相关系数、线性范围、最低检出量IDE为：y＝1.0826x－3.1713、r＝0.9988、0～40 ng／ml、0.1 ng／ml；NEP为：y＝0.1278x－6.2901、r＝0.9909、1～1000 pg／ml、1.0 pg／ml。标本样品中IDE和NEP测得结果见表2。

表2 4组小鼠脑组织中IDE和NEP的含量水平（¯x±s，n＝24）

2.3 脑病理学改变 营养干预7月时，小鼠脑组织做石蜡切片并进行HE染色。模型组小鼠明显发现海马和大脑皮层神经元减少，椎体细胞核固缩；阴性对照组未出现明显病理特点；干预组发现较少的海马和大脑皮层神经元减少，和较少的神经元固缩现象。免疫组化染色镜检可见模型组小鼠大脑皮层及海马分布有较多淡黄色斑块沉积（＋＋＋），低干预组和高干预组有较少的淡黄色沉积（＋），而阴性对照组小鼠海马及大脑皮层没有淡黄色沉积（－）。

3 讨论

目前研究认为Aβ纤维化后形成淀粉样沉积是AD的特殊病理改变之一，是AD的中心环节和始动因素［7］。在AD病理改变过程中，Aβ合成和降解失衡，过多Aβ聚集形成可溶性寡聚体，产生神经毒性，或直接导致神经元功能异常。研究发现，IDE调节Aβ降解在AD发生和发展过程中有着非常重要的意义。IDE作为降解酶可降解Aβ，调节机体内Aβ水平，AD患者脑内IDE水平降低［8⁃9］。有效提高脑内IDE水平可以减少Aβ单体生成，调节Aβ水平并阻止其形成淀粉样蛋白沉积，消除其神经毒性，延缓和改善AD病情。而NEP是Aβ分解代谢的降解酶和限速酶，其体内水平降低亦会促进Aβ的沉积，加速发生AD风险。研究发现，随着年龄增加，NEP活性下降，且AD患者脑中NEP水平亦明显降低［10⁃11］。如能有效提高NEP活性或水平，则能调节Aβ分解代谢，有效降解Aβ，减少Aβ过度沉积所致神经损伤，可以有效地预防和缓解AD的发生及发展。

近年来，多项研究表明营养素在AD的预防和改善症状中有积极的作用。其中维生素E能抑制脂质过氧化反应，保护细胞膜免受自由基进攻与过氧化损伤，还可通过其抗氧化作用减少Aβ蛋白的沉积和形成，使大脑免受神经毒害；叶酸对老年人认知损伤早期阶段的短时记忆有改善作用；B族维生素干预可使血浆同型半胱氨酸水平下降，维生素B6可通过参与调节神经递质合成代谢来影响学习记忆能力；叶黄素、多不饱和脂肪酸可以改善认知功能；矿物质硒、锌是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH⁃PX）的活性中心元素，与脑内IDE及NEP的活性密切相关，同时可以通过GSH⁃PX实现抗氧化作用；而蓝莓中的花青素具有从毛细血管渗入血液的性质，通过抑制毛细血管的通透性，达到强化毛细血管，防止脑内毛细血管损伤功能，从而延缓脑神经衰老，促进IDE和NEP活性提高。

本研究通过APP⁃PSN双转基因小鼠为动物模型，进行给予营养素干预，观察AD小鼠脑内IDE和NEP水平的影响。结果显示营养干预7月AD小鼠脑内IDE和NEP水平发生明显变化，高、低干预组与模型组比较有统计学差异（P＜0.01）；而高、低干预组与阴性对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）。小鼠脑组织石蜡切块做免疫组化染色，模型组小鼠大脑皮层及海马分布有较多淡黄色斑块沉积，高、低干预组分布有较少的淡黄色沉积，而阴性对照组小鼠海马及大脑皮层无淡黄色沉积。提示对APP⁃PSN双转基因小鼠进行营养素的干预能够提高其脑内IDE及NEP的活性及含量，减少Aβ淀粉样蛋白产生，可能有助于AD的预防和改善AD病情。

在AD随老龄化快速发展而增长，并且没有特效药物治疗的今天，通过营养干预改善老年认知功能，预防AD和延缓老年脑神经退行性改变具有现实意义，且非常必要。本研究结果显示采用矿物质、维生素、脂肪酸及抗氧化物质等营养素，既有独特的功能又有协同效应，通过多种途径、针对多种目标防止老年认知功能减退，以及增强神经退行性神经的修复，使脑内Aβ降解酶IDE和NEP活性升高，表达增强，降解和清除Aβ沉积，防止淀粉样斑块的形成，有效预防AD以及改善和延缓AD病情。营养素干预有望在AD的发病机制研究，以及预防和延缓AD发生发展中起到不可忽视的重要作用。

［1］ Ji HF，Shen L.Berberine：a potential multipotent natural product to combat Alzheimer's disease［J］.Molecules，2011，16（8）：6732⁃6740.

［2］ Armstrong RA.The pathogenesis of Alzheimer's disease：a reevaluation of the“amyloid cascade hypothesis”［J］.Int J Alzheimer's Dis，2011，2011：630865.

［3］ Butterfield DA，Swomley AM，Sultana R.Amyloid β⁃ peptide（1⁃42）⁃inducedoxidativestressinalzheimer disease：importance in disease pathogenesis and progression［J］.Antioxidants Redox Signal，2013，19（8）：823⁃835.

［4］ 唐璟群.脑啡肽酶与阿尔茨海默病的研究进展［J］.重庆医学，2010，39（15）：2068⁃2070.

［5］ 李洁颖，晏勇，蔡志友.胰岛素降解酶在阿尔茨海默病发病机制中的研究进展［J］.生命科学，2009，21（1）：126⁃130.

［6］ Liu YX，Guan HJ，Beckett TL，et al.In vitro and in vivo degradation of Abeta peptide by peptidases coupled to eryth⁃rocytes［J］.Peptides，2007，28（12）：2348⁃2355.

［7］ Hardy JA，Higgins GA.Alzheimer's disease：the amyloid cascade hypothesis［J］.Science，1992，256（5054）：184⁃185.

［8］ Pérea A，Morelli L，Cresto JC，et al.Degradation of soluble amyloid beta peptides 1⁃40，1⁃42，and the Dutch variant 1⁃40Q by insulin degrading enzyme from Alzheimer disease and control brains［J］.Neurochem Res，2000，25（2）：247⁃255.

［9］ Zhao Z，Xiang Z，Haroutunian V，et al.Insulin degrading enzyme activity selectively decreases in the hippocampal for⁃mation of cases at high risk to develop Alzheimer's disease［J］.Neurobiol Aging，2007，28（6）：824⁃830.

［10］Iwatan N，Takaki Y，Fukami S，et al.Region⁃specific of a beta⁃degrading endopeptidase，neprilysin，in mouse hippo⁃campus upon aging［J］.J Neurosci Res，2002，70（3）：493⁃500.

［11］Yasojima K，Mcgeer EG，Mcgeer PL.Relationship between beta amyloid peptide generating molecules and neprilysin in Alzheimer disease and normal brain［J］.Brain Res，2001，919（1）：115⁃121.

Effects of nutritional intervention on IDE and NEP levels in the brain of the transgenic mice with Alzheimer's disease

HE Ying，DANG Rui，WANG De⁃cai．
Department of Nutrition and Food Hygiene，Public Health College；CUI Yu，WU Qun⁃hong．Department of Social Medicine，Public Health College，Harbin Medical University，Harbin 150081，China；SUN Xiao⁃hong．The First Harbin City Social Welfare Institute，Harbin 150081，China；WANG Chao．Department of Nutri⁃tion，Yanzhou People's Hospital，Jining 272100，China

Objective To investigate the effects of nutritional intervention on brain insulin degrading enzyme（IDE）and neprilysin（NEP）levels in APP⁃PSN transgenic mice with Alzheimer's disease（AD），and to study the mechanism of combined nutrients on prevention and remission for AD. Methods Seventy⁃two APP⁃PSN transgenic mice aged two months were randomly divided into the intervention group supplied with compound recipe in the diet and the model group fed with basic feed，and the intervention group were divided into high⁃and low⁃dose group.Another 24 APP⁃PSN transgenic negative mice were selected as negative control group.After intervention for 7 months，immunohistochemistry staining was used to evaluate the pathology in brain，and the levels of IDE and NEP in mice brain were detected by ELISA. Results By immunohistochemical staining with antibody against beta Amyloid1⁃42（Aβ1⁃42），hippocampus and cerebral cortex in model group mice appeared more typical flaxen plaque deposition（＋＋＋），and high⁃and low⁃dose group showed less pale yellow plaque deposition（＋），and plaque deposits was not found in negative control group（－）.Compared with model group，the levels of IDE and NEP in high⁃and low⁃dose groups showed significant difference（P＜0.05）. Conclusions Compound nutrition intervention may improve AD，through improving the activity and levels of IDE and NEP in APP⁃PSN double transgenic mice and delaying the deposition of amyloid plaques in the cerebral cortex and the hippocampus of APP⁃PSN mice.

Alzheimer's disease；insulin degrading enzyme；neprilysin；amyloid beta protein

R 749.16

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.03.015

2014⁃06⁃09）

国家自然科学基金面上项目（81273193）

150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室（何颖，党瑞，王德才）；卫生管理学院（崔宇，吴群红）；150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨市第一社会福利院（孙晓红）；272100山东省济宁市，济宁市兖州区人民医院营养科（王超）

王德才，Email：decaiwang＠live.cn